植物細(xì)胞壁中表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG)，是果膠酶的一種，能夠特異性消化水解植物細(xì)胞壁中的多聚半乳糖醛酸，將其分解成較小的片段，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞壁降解的功能。這一功能的實(shí)現(xiàn)，在植物細(xì)胞的生長(zhǎng)，延伸，植物病蟲(chóng)害防治，花粉的傳播等方面，都起著至關(guān)重要的作用。
目前的研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于植物的基因組中，有多種基因可以編碼PG蛋白，且翻譯形成的成熟蛋白，在序列和結(jié)構(gòu)上相對(duì)比較保守。但從功能上，多種PG蛋白，其與底物結(jié)合的特性，催化水解后形成的產(chǎn)物，蛋白表達(dá)的調(diào)控方式，均表現(xiàn)出差異。上述差異與蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系，以及這些差異對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的影響，是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。
本文通過(guò)對(duì)PGLR和ADPG2兩種PG蛋白的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)的差異與酶和底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)差異的相關(guān)性。對(duì)于不同PG蛋白功能有了更深入的了解。
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不同PG蛋白的結(jié)構(gòu)差異及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的差異；
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PG蛋白與不同底物結(jié)合的結(jié)合動(dòng)力學(xué)差異；
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酶和底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)差異和酶消化水解底物的功能之間的關(guān)系；
（1）純化各種不同的PG蛋白，進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析與電鏡結(jié)構(gòu)解析；
對(duì)PG蛋白及其底物結(jié)合的蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)PG蛋白結(jié)合底物的活性位點(diǎn)；
（2）使用分子互作技術(shù)switch SENSE研究在結(jié)構(gòu)上保守，活性位點(diǎn)具有差異的不同PG蛋白，如何影響與不同底物結(jié)合的狀態(tài)以及結(jié)合動(dòng)力學(xué)上的差異；
將純化后的PG蛋白做為配體與switch SENSE芯片上的納米桿進(jìn)行耦聯(lián)，并進(jìn)行芯片的功能化處理。形成的具有功能的芯片，與微流控液流中的底物分子發(fā)生相互作用，釋放出熒光光子，檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)合/解離動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。
（3）研究酶和底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)差異與酶作用底物的時(shí)空性和產(chǎn)生的水解產(chǎn)物類(lèi)型之間的關(guān)系。
PGLR和ADPG2兩種pG蛋白在結(jié)構(gòu)上都呈現(xiàn)右手螺旋的β螺旋的保守結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)對(duì)于果膠酶家族成員是常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。β螺旋結(jié)構(gòu)由三個(gè)平行重復(fù)的β折疊PB1，PB2和PB3組成，分別包含11，12和11個(gè)平行β鏈；PGLR蛋白由于無(wú)法和PGLR抑制劑PGIPs結(jié)合，因此，無(wú)法抑制其酶活性，而PGIPs可以和真菌中的PG蛋白發(fā)生相互作用，進(jìn)而抑制其酶活性。為了進(jìn)一步理解PGLR缺少抑制劑結(jié)合和發(fā)揮活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，本文進(jìn)一步解析了鐮刀菌素中(FpPG1) - PvPGIP2蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PG蛋白的N端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)pPG1,結(jié)構(gòu)中存在的 a S120-N121-S122-N123 的末端延伸，對(duì)于PG蛋白和PGIPs的結(jié)合至關(guān)重要。PGLR 和ADPG2 N端雖然同樣存在環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但是其結(jié)構(gòu)上相對(duì)比較冗長(zhǎng)且具有不同的氨基酸殘基，限制了該種類(lèi)PG蛋白和PGIPs蛋白的結(jié)合。
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該數(shù)據(jù)證明了PG家族蛋白PGLR和ADPG2與PGIP結(jié)合受到影響的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
對(duì)于PG蛋白和底物分子的結(jié)合，同樣存在結(jié)構(gòu)上的影響。將植物中的PGLR和ADPG2和細(xì)菌與真菌中的PG家族蛋白進(jìn)行蛋白序列和結(jié)構(gòu)的比較，發(fā)現(xiàn)在上述物種中，酶活性位點(diǎn)是由NTD，DD, GHG, RIK四個(gè)保守的結(jié)構(gòu)基序組成。通過(guò)對(duì)保守部位活性位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，分析了PGLR和ADPG2對(duì)PGA的催化水解關(guān)鍵氨基酸，以及不同突變蛋白與其底物DP12結(jié)合的親和常數(shù)的差異。
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上數(shù)據(jù)解析了PGLR和ADPG2蛋白酶活性位點(diǎn)的保守殘基
蛋白活性位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的差異，導(dǎo)致了不同的PG蛋白對(duì)同一種底物不同的選擇和水解消化活性；以及決定著PG蛋白與其特異性底物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。為了進(jìn)一步檢測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)與酶和底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)相互關(guān)系，本文使用分子互作技術(shù)switchSENSE對(duì)酶和底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究。switchSENSE是通過(guò)芯片表面的DNA納米桿，實(shí)現(xiàn)對(duì)分子互作的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其DNA納米桿設(shè)計(jì)的靈活性，可以通過(guò)靜態(tài)模式以及動(dòng)態(tài)模式，分別對(duì)分子與分子之間結(jié)合的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行實(shí)時(shí)的測(cè)量，同時(shí)可以對(duì)生物大分子蛋白結(jié)構(gòu)及大小的相對(duì)變化進(jìn)行測(cè)定。其主要的結(jié)構(gòu)如下圖所示：
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該技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
（1）DNA納米桿攜帶熒光基團(tuán)，待分析物不需要進(jìn)行標(biāo)記；
（2）DNA納米桿可與DNA, 蛋白結(jié)合，可進(jìn)行多種分子模式的互作，包括DNA和DNA結(jié)合蛋白，蛋白與蛋白，小分子與蛋白分子結(jié)合的相互作用分析；
（3）由于DNA納米桿在芯片上的自由組裝，可進(jìn)行復(fù)雜的三元復(fù)合物，雙特異抗體與靶點(diǎn)形成的復(fù)合物相互作用分析，解決了傳統(tǒng)技術(shù)在此方面的限制。
由于PG蛋白的底物種類(lèi)繁多，具有不同聚合體形式，為了檢測(cè)具有不同聚合形式的底物和同種PG蛋白的實(shí)時(shí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)，需要進(jìn)行自動(dòng)化的連續(xù)上樣，且可以在同一塊芯片上實(shí)現(xiàn)。
switchSENSE具有96孔自動(dòng)化上樣裝置，且芯片上帶有配體的DNA納米桿可以進(jìn)行完全解離后，使得芯片再生，繼而自動(dòng)化進(jìn)行多種底物的結(jié)合解離分析。
本文通過(guò)這種方式，對(duì)不同聚合形式的底物與PGLR和ADPG2的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了實(shí)時(shí)的分析，結(jié)果如下：
4以上數(shù)據(jù)分析了不同的底物和PGLR以及ADPG2結(jié)合的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)
結(jié)合動(dòng)力學(xué)的精確測(cè)量，對(duì)于研究PGLR和ADPG2等PG蛋白的功能是必不可少的。這一數(shù)據(jù)直觀的反映了酶和底物結(jié)合的狀態(tài)，包括形成復(fù)合物的速率，復(fù)合物的穩(wěn)定性等。
數(shù)據(jù)顯示了ADGP2相比于PGLR，其和低聚的底物具有更高的親和性，但是，在結(jié)合速率常數(shù)上，對(duì)于低聚的果膠底物，ADPG2和PGLR并沒(méi)有顯示出明顯的差異，這也說(shuō)明，其結(jié)構(gòu)上的差異，并沒(méi)有引起兩種酶對(duì)底物的結(jié)合，但是或許影響了酶和底物復(fù)合物的穩(wěn)定性。
為了更進(jìn)一步對(duì)動(dòng)力學(xué)的差異和酶對(duì)底物的水解的差異的研究，本文進(jìn)行了該方面的相關(guān)性分析。研究顯示，由于兩種酶對(duì)不同聚合形式底物的親和力的差異，ADPG2和PGLR在發(fā)揮活性上是具有時(shí)間順序，ADPG2可以進(jìn)一步水解PGLR消化水解后的終端產(chǎn)物。
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以上數(shù)據(jù)說(shuō)明不同的酶底物動(dòng)力學(xué)親和性與不同的底物催化能力的關(guān)系
本文通過(guò)對(duì)PG蛋白家族成員PGLR和ADPG2的結(jié)構(gòu)分析，闡明了兩種果膠水解酶的蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)酶活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基位點(diǎn)進(jìn)行了解析；這些結(jié)構(gòu)的差異，引起了酶與底物結(jié)合的不同的動(dòng)力學(xué)。動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)讓研究者們直觀的觀測(cè)到酶和底物結(jié)合的狀態(tài)以及對(duì)不同底物的選擇性，酶和底物結(jié)合后形成復(fù)合物的穩(wěn)定性等。以上決定了酶在細(xì)胞壁中果膠的水解中所占據(jù)的時(shí)空特點(diǎn)，這對(duì)于植物細(xì)胞的生長(zhǎng)，根莖的發(fā)育等，都具有一定可科學(xué)指導(dǎo)價(jià)值。
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heliX+分子互作分析系統(tǒng)采用switchSENSE®技術(shù)，通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)或標(biāo)簽捕獲方式將感興趣的分 子（配體）固定在heliX®芯片上,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化 工作流程為分子互作提供高效解決方案。
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