在缺乏ATR激酶的情況下，模擬的磷酸化的蛋白FANCI仍舊可以促進FANCD2的泛素化，這說明ATR激酶通路實質(zhì)上是通過促進FANCI的磷酸化激活FA信號通路，促進FANCD2的泛素化發(fā)生。那么磷酸化是如何影響泛素化發(fā)生的呢？為了回答這個問題，本文純化了三種蛋白：模擬的來源于雞的FANCI磷酸化蛋白（簡稱D2-I 3D），在該蛋白中，三個保守的磷酸化位點，絲氨酸558，絲氨酸561和蘇氨酸567，被突變成天冬氨酸；野生型的FANCI蛋白（D2-I WT）和失去被磷酸化功能的FANCI蛋白（D2-I 3A），在該蛋白中，上述三個保守位點被突變成丙氨酸。

這三種蛋白對于FANCD2的泛素化分別有什么影響呢？本文進行了體外的泛素化檢測，在44bp的dsDNA和重組的FA核心蛋白復(fù)合物存在的情況下，WT和I-3A對FANCD2的泛素化影響是相一致的，在20分鐘內(nèi)，約40%的FANCD2發(fā)生了泛素化；而I-3D的泛素化效率明顯提高，在10分鐘后，約75%的FANCD2蛋白發(fā)生了泛素化，20分鐘后，大于95%的FANCD2發(fā)生了泛素化。這些結(jié)果說明，F(xiàn)ANCI的磷酸化可以促進FA對FANCD2的泛素化作用。

ATR的磷酸化位點位于FANCI的靈活可變區(qū)域，與FANCI的泛素化位點，F(xiàn)A核心復(fù)合物成分，Ube2T及USP1-UAF1結(jié)合位點相鄰，報道將其稱為“磷酸環(huán)”。在非泛素化的鼠的D2-I晶體結(jié)構(gòu)中，磷酸環(huán)位于FANCD2和FANCI蛋白互作界面，處于一個氫鍵構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)之中；但并沒有相關(guān)的電鏡結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，說明磷酸環(huán)的內(nèi)部是靈活可變的，并不容易進行相關(guān)的結(jié)構(gòu)解析。

為了從結(jié)構(gòu)的角度分析FANCI的磷酸化是如何促進FANCD2泛素化的發(fā)生，本文對D2-I 3D，D2-I3D和DNA，泛素化的D2-I 3D和DNA進行了電鏡結(jié)構(gòu)解析，其分辨率分別是4.1，3.5和4.4?.  D2-I 3D在沒有DNA存在的情況下，在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)的是更加“打開”的狀態(tài)，這說明磷酸化本身并不能改變蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但是在DNA存在的情況下，泛素化的D2-I 3D與DNA結(jié)合上呈現(xiàn)的是更加緊湊的狀態(tài)。那么是泛素化的發(fā)生，還是DNA存在的本身，對D2-I 3D的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響呢？影響的意義是什么呢？在DNA存在的情況下，D2-I 3D與DNA的結(jié)合呈現(xiàn)了緊湊的狀態(tài)，這與之前的研究結(jié)果相悖，已有的報道發(fā)現(xiàn)非泛素化的DNA-D2-I結(jié)合復(fù)合物中，D2-I呈現(xiàn)的是“打開”的狀態(tài)，緊湊的結(jié)構(gòu)狀態(tài)是由于泛素化得到發(fā)生而引起的。

本文構(gòu)建了一個DNA-D2-I 3D復(fù)合物模型，并將其與已報道的D2-I的結(jié)構(gòu)進行比較。除了FANCD2的可變的N端區(qū)域，D2-I 3D的緊湊狀態(tài)并不影響單個亞基的總體結(jié)構(gòu)狀態(tài)。為了實現(xiàn)與DNA結(jié)合的緊湊狀態(tài)，F(xiàn)ANCD2和FANCI 3D會繞著它們N端形成的鉸鏈進行旋轉(zhuǎn)，使得它們的蛋白C端可以接近，進而發(fā)生互作，并與DNA形成一個新的相互作用界面。結(jié)合上述的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，F(xiàn)ANCI的磷酸化在DNA存在的情況下，可以促進D2-I復(fù)合物與DNA結(jié)合的緊湊性，DNA在其中的作用，可能充當一個旋轉(zhuǎn)軸心的作用，或是類似于支架的作用；如果沒有DNA的存在，這種旋轉(zhuǎn)并不會發(fā)生，新的互作界面也不會發(fā)生。

那么這種緊湊的結(jié)構(gòu)狀態(tài)的發(fā)生的意義是什么呢？由于結(jié)構(gòu)的改變，使得FANCD2和FANCI隱藏的泛素化位點暴露，F(xiàn)A核心復(fù)合物復(fù)合體成分可以與其發(fā)生作用。

以上結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明，磷酸化通過以下機制促進了D2-I的泛素化：磷酸化的蛋白復(fù)合物，在dsDNA存在的情況下，發(fā)生結(jié)構(gòu)上狀態(tài)的變化，從“打開”的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬o湊”的狀態(tài)，這種轉(zhuǎn)變，暴露了關(guān)鍵的泛素化位點Lys563。

除了結(jié)構(gòu)上的改變，促進了泛素化的發(fā)生，那么FANCI的磷酸化是否影響了復(fù)合物與DNA結(jié)合的動力學(xué)，比如降低解離率，延長復(fù)合物與DNA互作的時間等。已有的研究發(fā)現(xiàn)，模擬的FANCI磷酸化突變通過增加復(fù)合物與DNA結(jié)合的親和性，促進FANCD2的泛素化。為了進一步驗證D2-I 3D和野生型復(fù)合物D2-I與DNA結(jié)合的親和性差異，我們通過凝膠遷移滯后實驗（EMSA）檢測D2-I WT，D2-I 3A和D2-I 3D與DNA結(jié)合的親和性。但是，本文并沒有檢測到明顯的差異。

本文考慮到EMSA技術(shù)受限于分辨率，對細微的差異無法進行檢測。例如，比較慢的結(jié)合/解離與較快的結(jié)合/較快的解離可能具有相似的親和性。因此，我們采用了SwitchSENCE技術(shù)對上述復(fù)合物進行了實時動力學(xué)檢測。SwitchSENCE采用熒光標記的DNA納米桿，納米桿固定在芯片表面，并處于可變的電場之中。當待結(jié)合的蛋白經(jīng)微流控液流流經(jīng)芯片表面時，DNA和蛋白結(jié)合的實時動力學(xué)可以通過檢測DNA納米桿在電場中的熒光改變速度進行測量。由于雙鏈DNA納米桿一端固定在芯片上，另一端設(shè)計成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此可以避免蛋白復(fù)合物從DNA鏈上的滑落，導(dǎo)致數(shù)據(jù)產(chǎn)生的復(fù)雜性和不可控性。結(jié)果顯示，三種不同的復(fù)合物在結(jié)合/解離動力學(xué)上不存在明顯的差異。但相比較于EMSA，對于三種復(fù)合物，SwitchSENCE測得的親和性更加高，這也可能是由于DNA存在形式的差異。

以上結(jié)果說明，復(fù)合物的磷酸化狀態(tài)并不能明顯改變其與DNA結(jié)合的動力學(xué)。

雖然已經(jīng)驗證復(fù)合物的磷酸化可以影響其開合狀態(tài)，但是否與其泛素化的發(fā)生相關(guān)，并不清楚。本文認為D2-I的磷酸化主要是通過影響發(fā)夾結(jié)構(gòu)的開合狀態(tài)影響復(fù)合物的泛素化。為了檢測FA核心復(fù)合物蛋白與D2-I WT和D2-I 3D結(jié)合的差異，我們在DNA缺失或在限制濃度下進行泛素化檢測。首先，在DNA缺失的情況下，D2-I WT復(fù)合物并不能有效的發(fā)生泛素化，2小時反應(yīng)，僅有大約5%發(fā)生了泛素化反應(yīng)。但是D2-I 3D發(fā)生泛素化的速率是D2-I WT的10倍左右，即使在DNA缺失的情況下。所以，泛素化的發(fā)生依賴于磷酸化，但是否依賴于DNA呢？或則磷酸化本身是依賴于DNA存在的呢？有限的DNA的加入，促進了D2-I 3D的泛素化，但對D2-I WT并未產(chǎn)生影響。這說明，泛素化依賴于復(fù)合物的磷酸化，但DNA的存在可以極大的促進該泛素化過程。DNA是通過什么機制促進這一泛素化過程的呢？DNA在該過程中的作用是什么呢？本文推測是起到穩(wěn)定復(fù)合物“緊湊”的狀態(tài)。

為了更進一步從構(gòu)象的角度探究D2-I WT和D2-I 3D的存在差異，我們通過定量交聯(lián)質(zhì)譜對溶液中的復(fù)合物狀態(tài)進行分析。我們使用一種半衰期較短，UV-激活的異源雙功能交聯(lián)劑sulfosuccinimidyl 4,4’-azipentanoate (sulfo-SDA），在DNA存在與否的情況下，對D2-I WT和D2-I 3D復(fù)合物分別進行交聯(lián)，可以獲得短時狀態(tài)下的分子內(nèi)部互作狀態(tài)。對于D2-I 3D復(fù)合物來說，DNA不存在時的交聯(lián)模式和構(gòu)象狀態(tài)與兩種復(fù)合物DNA存在時的差異比較一致，但與DNA不存在時，D2-I 3D的差異比較明顯。這說明，磷酸化與DNA分子都是影響復(fù)合物構(gòu)象狀態(tài)的因素。那么磷酸化因素是如何影響復(fù)合物構(gòu)象狀態(tài)的呢？本文在DNA缺失的情況下，對D2-I WT和D2-I 3D分別進行了定量交聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種復(fù)合物在DNA缺失的情況下，形成了相似的構(gòu)象，但是特定的交聯(lián)數(shù)量存在差異，說明在構(gòu)象的狀態(tài)上存在一定的差異。

通過更精細的數(shù)據(jù)分析，本文發(fā)現(xiàn)，在D2-I WT和D2-I 3D兩種復(fù)合物的構(gòu)象狀態(tài)方面主要存在兩種主要的差異。首先，不同的交聯(lián)簇表明兩種復(fù)合物的無序N端位置上的不同；在D2-I WT復(fù)合物中，F(xiàn)ANCD2的N端與FANCI的patch交聯(lián)，該位置位于D2-I復(fù)合物互作界面，并與磷酸環(huán)和FANCI-K525氨基酸相接近。這種交聯(lián)的狀態(tài)在D2-I 3D復(fù)合物中并不是主要的交聯(lián)，相反，其與FANCI交聯(lián)的區(qū)域與復(fù)合物互作界面相距較遠。

以上數(shù)據(jù)進一步表明，磷酸化和DNA的結(jié)合對復(fù)合物D2-I具有相似的效應(yīng)，改變其N端序列的交聯(lián)狀態(tài)，促進復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮椤熬o湊”的狀態(tài)。

其次，在泛素化位點附近，具有特定的交聯(lián)模式。我們知道，在D2-I復(fù)合物的“打開”狀態(tài)中，這些關(guān)鍵的泛素化位點未經(jīng)暴露，在D2-I 3D復(fù)合物中，交聯(lián)模式的改變，使得這些氨基酸殘基發(fā)生暴露，使得FA復(fù)合物蛋白更易與其接近。

除了復(fù)合物N端的交聯(lián)狀態(tài)，本文也同時對C端的交聯(lián)模式進行了分析。這種交聯(lián)僅在DNA存在的情況下，復(fù)合物呈現(xiàn)更為”緊湊“的狀態(tài)時發(fā)生。D2-I WT和D2-I 3D在DNA存在時，都可以圍繞DNA形成“緊湊”狀態(tài)，但在D2-I 3D復(fù)合物中，比起D2-I WT，C端交聯(lián)高達3倍的富集程度。表明在D2-I 3D復(fù)合物中，“緊湊”狀態(tài)的維持時間，長于D2-I WT。

通過以上結(jié)果，本文證實，D2-I復(fù)合物存在“開”和“合”的構(gòu)象動態(tài)平衡，無論DNA存在與否。與DNA結(jié)合導(dǎo)致的效應(yīng)相似，磷酸化可以改變復(fù)合物的構(gòu)象平衡，促進復(fù)合物從“打開”狀態(tài)向“緊湊”狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。