由于絕大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌尚未被成功培養(yǎng)，因此它們的基因組、新陳代謝潛力以及在環(huán)境中的功能仍未得到充分研究；我們將這些微生物稱為微生物暗物質(zhì)[1-5]。單細(xì)胞基因組學(xué)是研究微生物暗物質(zhì)的重要手段，但全基因組擴(kuò)增步驟存在諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)全基因組擴(kuò)增方法（MDA）雖常用，但成本高且對特定基因組區(qū)域存在擴(kuò)增偏差，導(dǎo)致基因組覆蓋不均，限制了其在高通量研究中的應(yīng)用，難以獲取高質(zhì)量基因組，尤其是微生物群落中的少數(shù)類群基因組[6,7]。
在微生物研究領(lǐng)域，單細(xì)胞基因組學(xué)（SCG）為探索微生物暗物質(zhì)（MDM）提供了關(guān)鍵途徑[8-10]。然而，全基因組擴(kuò)增這一關(guān)鍵步驟面臨諸多挑戰(zhàn)，如成本高昂、擴(kuò)增偏差以及污染問題等，嚴(yán)重制約了研究的深入開展。
I.DOT非接觸式移液器的技術(shù)核心及優(yōu)勢
非接觸式液體轉(zhuǎn)移：在納升至微升范圍內(nèi)，實現(xiàn)極低死體積（<1 μL）和零交叉污染風(fēng)險的液體轉(zhuǎn)移，為細(xì)胞培養(yǎng)提供前所未有的精確度和安全性。
Drop Detection系統(tǒng)：對每個液滴進(jìn)行計數(shù)和檢測，確保實驗的可重復(fù)性和可靠性，提高實驗效率。
本篇推文主要介紹I.DOT 技術(shù)在微生物單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增研究中的應(yīng)用。旨在解決傳統(tǒng)全基因組擴(kuò)增方法（如MDA）成本高、擴(kuò)增偏差大及污染等問題，為微生物單細(xì)胞基因組學(xué)研究提供新方法。
實驗方法
第一步：細(xì)胞培養(yǎng)與分離
培養(yǎng)大腸桿菌 K12 MG1655 至指數(shù)生長期，在UV-去污染的 ISO 4級潔凈室中處理，用 BD FACS Melody 將細(xì)胞分選至384孔板，低溫保存。
第二步：細(xì)胞裂解
采用改良裂解緩沖液[11]，通過I.DOT mini將裂解液分配到細(xì)胞上并放入不含細(xì)胞的孔中（陰性對照）。在21℃下孵育10分鐘，通過加入等體積的中和緩沖液來中和。
第三步：多重置換擴(kuò)增（MDA）
用 REPLI-g單細(xì)胞試劑盒進(jìn)行MDA反應(yīng)，然后用I.DOT mini將REPLI-g主混合液分配到裂解的細(xì)胞和陰性對照上，使最終的MDA體積為0.5, 0.8, 1.0, 1.25, 5, 10 μL。MDA在CFX-384熱循環(huán)器（Bio-Rad, Hercules，CA，USA）中在30℃下孵育6小時，然后在65?C下孵育10分鐘以停止擴(kuò)增并保持在4℃。擴(kuò)增的DNA保存在?20℃，直到用于文庫準(zhǔn)備。
第四步：文庫制備與測序
在紫外線凈化的層流PCR工作臺進(jìn)行相關(guān)操作，包括純化、文庫制備，最后用 Illumina NextSeq 550 測序。
第五步：數(shù)據(jù)處理及分析
使用多種工具進(jìn)行質(zhì)量檢測、修剪、歸一化、去污染、去重、比對、組裝和質(zhì)量評價[7,12-19]
1、使用FastQC和Trim Galore軟件對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢查和修剪。
2、用BBTools軟件將修剪后的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化到約200倍的測序深度，并進(jìn)行了不同深度（100×, 80×, 60×, 40×, 20×）的下采樣，以分析測序深度對覆蓋度的影響。
3、使用FASTQ-Screen軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行污染評估，并保留大腸桿菌的多映射讀取。
4、利用BBTools軟件去除PCR重復(fù)序列。
5、將讀取數(shù)據(jù)映射到大腸桿菌MG1655參考基因組，并計算10 kb區(qū)間的覆蓋度。
6、在進(jìn)行de novo組裝前，使用bbnorm.sh軟件對讀取覆蓋度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
7、使用SPAdes軟件進(jìn)行單細(xì)胞模式下的組裝，并用QUAST和MDMcleaner軟件評估組裝質(zhì)量和污染程度。
8、使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括ANOVA和Kruskal-Wallis測試，以及t-Test進(jìn)行成對比較。
9、使用R軟件的ineq包計算Gini指數(shù)，并用ggplot2創(chuàng)建讀取深度和Lorenz曲線圖。
實驗數(shù)據(jù)分析
1、在384孔板上進(jìn)行總反應(yīng)體積為0.5、0.8、1.0、1.25、5.0和10 μL的MDAs（表A1）。最小濃度0.5μL的MDA反應(yīng)不起作用，0.8 μL和1.0 μL反應(yīng)的擴(kuò)增成功率分別只有68.75%和62.50%。相比之下，1.25 μL MDA反應(yīng)的成功率為87.50%，而5.0 μL和10 μL MDA反應(yīng)的成功率均為100%。在較低的丙二醛反應(yīng)體系中，較低的成功率可能是由于在小體積中聚合酶的蒸發(fā)或位阻[20,21]。平均而言，放大達(dá)到檢測閾值所需的時間(用Cq)；1.25 μL的MDA反應(yīng)體積（圖1A）反應(yīng)時間最早。先前的研究報道，Cq值越早，基因組恢復(fù)成功率和質(zhì)量越高[11,22]。此外，我們檢測到的相對熒光（RFU）終點和成功反應(yīng)的DNA產(chǎn)率隨著反應(yīng)體積的減少而下降（圖1A，B），最初表明體積的減少可能限制了MDA的指數(shù)性質(zhì)[23,24]，這應(yīng)該提高基因組的覆蓋率和均勻性。為了進(jìn)一步比較WGA反應(yīng)的質(zhì)量，根據(jù)Cq和RFU值選擇每種不同MDA反應(yīng)體積的5個擴(kuò)增重復(fù)，然后使用等量的DNA進(jìn)行Illumina測序。
圖1. MDA反應(yīng)統(tǒng)計概述。(A)平均丙二醛反應(yīng)動力學(xué)的反應(yīng)大小。標(biāo)準(zhǔn)誤差條表示使用每個反應(yīng)體積的所有五個重復(fù)計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)按反應(yīng)大小計算的MDA平均擴(kuò)增率。相對熒光單（RFU）指SYTO?-13用實時熱循環(huán)儀測得的熒光信號。SYTO?-13用于監(jiān)測MDA的進(jìn)展，因為它在擴(kuò)增時與雙鏈DNA結(jié)合。方框的中線代表中位數(shù)，x代表平均值。用5個重復(fù)進(jìn)行計算。
2、不同MDA反應(yīng)體積在讀取修剪過程中丟失的讀取數(shù)量存在顯著差異（圖2A），其中1.25 μL的MDA反應(yīng)體積在讀取質(zhì)量修剪中丟失的讀取數(shù)量顯著少于其他體積（p ≤ 0.05）。修剪后，所有樣本被標(biāo)準(zhǔn)化到200×測序深度，以便公平比較不同反應(yīng)體積的映射和組裝質(zhì)量。盡管較大體積反應(yīng)的平均重復(fù)讀取數(shù)量較多（圖2B），但差異并不顯著（p = 0.0870）。這可能與大體積MDA反應(yīng)中模板特異性較低有關(guān)[25,26]，導(dǎo)致更多的錯誤引物結(jié)合和擴(kuò)增，尤其是在模板濃度非常低時。此外，較大的反應(yīng)體積在過濾后去除的污染讀取也較多（圖2C），這可能是由于背景污染與大腸桿菌單細(xì)胞DNA之間的競爭增加所致[25,27]。總的來說，5和10 μL的MDA反應(yīng)體積結(jié)果一致性較差，表現(xiàn)為重復(fù)之間的變異性較大（圖2）。
圖2. 讀取處理統(tǒng)計數(shù)據(jù)。(A)在質(zhì)量修剪期間去除讀數(shù)的百分比。(B)去除PCR重復(fù)的百分比。(C)讀數(shù)污染物過濾后保留的讀數(shù)百分比。方框的中線代表中位數(shù)，x代表平均值。用5個重復(fù)進(jìn)行計算
3、由于模板特異性較低，高于1.25 μL的MDA反應(yīng)量在對參比大腸桿菌MG1655基因組的讀取定位中也表現(xiàn)較差，如基因組覆蓋寬度和覆蓋均勻性所示（圖3A，B）。而1.25 μL的反應(yīng)體積在384孔板中被認(rèn)為是改善MDA的“最佳點”。1.25 μL MDA反應(yīng)體積的平均讀取覆蓋了大腸桿菌基因組的85%，比其他體積的反應(yīng)高出19%到40%（圖3A）。與WGA-X?方法相比，我們的覆蓋度提高了約19%，即使在讀取映射過程中使用了大約200萬更少的讀取。此外，1.25 μL反應(yīng)體積的覆蓋度均勻性更高，這通過Lorenz曲線和Gini指數(shù)（衡量覆蓋度均勻性的指標(biāo)）得到了證實，Gini指數(shù)在1.25 μL反應(yīng)中最低，表明其覆蓋度最均勻（圖5B）。這些結(jié)果表明，1.25 μL的MDA反應(yīng)體積在提高基因組覆蓋度和均勻性方面具有顯著優(yōu)勢。
圖3. 基因組覆蓋率和覆蓋一致性偏差。（A） 在大腸桿菌基因組的10kb區(qū)間內(nèi)計算每個復(fù)制的讀取深度。圖表顯示了每個反應(yīng)體積的所有重復(fù)的平均值。Cov. 是平均覆蓋寬度，即至少一次讀取覆蓋的基因組位置的百分比。（B）在大腸桿菌基因組的10kb區(qū)間內(nèi)計算讀取覆蓋率和深度的均勻性，并對每個反應(yīng)體積的所有五個重復(fù)進(jìn)行平均。
4、對所有復(fù)制的單放大基因組（SAGs）進(jìn)行了組裝和比較。結(jié)果顯示，由于MDA引入的大差異，我們在組裝前將讀取深度標(biāo)準(zhǔn)化至100×的目標(biāo)深度。然而，小于和大于1.25 μL的MDA反應(yīng)體積由于在預(yù)處理步驟中丟失了更多讀取，導(dǎo)致最終序列深度較低，從而使得組裝質(zhì)量較1.25 μL MDA反應(yīng)體積的組裝結(jié)果差（圖4A-C）。具體來說，1.25 μL反應(yīng)的平均總長度和N50（代表50%總序列長度的最短contig序列長度）分別為3,522,851 bp和46,179 bp（圖4B,C），表明這些組裝更加連續(xù)，質(zhì)量更高。同時計算了組裝覆蓋度和完整性，覆蓋度是指與參考基因組映射的組裝（contigs）的百分比[70]，而基因組完整性則是通過MDMcleaner估計標(biāo)記基因的存在。1.25 μL MDA反應(yīng)的組裝覆蓋度和完整性顯著高于其他體積，平均約為75%和94%，污染最低（圖6D-F）。其中三個1.25 μL MDA反應(yīng)復(fù)制的覆蓋度甚至超過了75%，最高達(dá)到89.5%。相比之下，WGA-X?即使使用了約5倍多的讀取，大腸桿菌組裝覆蓋度也低于60%。我們的10 μL MDA反應(yīng)的組裝覆蓋度與WGA-X?在10 μL反應(yīng)中報告的范圍一致，這表明WGA-X?也可能從進(jìn)一步的體積減少中受益。與其他體積減少方法相比，我們的更高組裝覆蓋度與之前報告的大腸桿菌MDA在皮升級液滴（88-91%）[28]和納升級液滴（88-94%）[27]中的覆蓋度范圍一致。
圖4. 單擴(kuò)增基因組（SAG）組裝統(tǒng)計。(A)最終序列深度，以基因組內(nèi)每個堿基平均測序的估計次數(shù)計算。(B)組合的總平均長度，(C) N50平均值，支持50%基因組組合所需的最小組合長度，(D)整個基因組中組合的覆蓋率百分比。大腸桿菌MG1655參考基因組，均采用QUAST測定[13]。(E)組裝基因組的完整性和(F)組裝中受污染堿基的百分比，用MDMCleaner[7]測定。方框的中線代表中位數(shù)，x代表平均值。用5個重復(fù)進(jìn)行計算。
總結(jié)與討論
總體而言，1.25 μL 的 MDA 反應(yīng)體積顯著優(yōu)于傳統(tǒng) 50 μL反應(yīng)，成本降低約 97.5%，基因組覆蓋度和均勻性大幅提升，產(chǎn)生更完整、偏差更小的單擴(kuò)增基因組（SAGs）。相比其他體積降低方法，該方法在標(biāo)準(zhǔn)384孔板中更易操作，可提高微生物單細(xì)胞基因組學(xué)研究可行性，有助于深入探索微生物多樣性和功能，特別是針對稀有物種和微生物暗物質(zhì)研究。I.DOT技術(shù)在本研究中的應(yīng)用，不僅提高了單細(xì)胞基因組擴(kuò)增的效率和準(zhǔn)確性，還降低了成本，使得SCG更易于在未來的研究中應(yīng)用。這項技術(shù)為研究3D細(xì)胞培養(yǎng)模型中的細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供了強(qiáng)大工具，有助于在更接近生理條件下研究各種生物學(xué)過程，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的思路和方法。
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