在細(xì)胞生物學(xué)和藥物研發(fā)中，傳統(tǒng)研究流程需在微孔板、離心管、PCR板等多平臺(tái)間轉(zhuǎn)移樣本，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)變異大（跨平臺(tái)誤差>20%）、核酸損失高（低細(xì)胞數(shù)樣本回收率<50%）。例如，基因表達(dá)分析需多次轉(zhuǎn)移樣本，單細(xì)胞核酸損失率高達(dá)70%。本篇文章中德國(guó)卡爾斯魯厄理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的“Cells-to-cDNAonChip”技術(shù)，通過(guò)液滴微陣列（DMA）平臺(tái)與I.DOT非接觸式納升級(jí)分配技術(shù)的結(jié)合，首次實(shí)現(xiàn)從活細(xì)胞培養(yǎng)到cDNA合成的全流程納升級(jí)集成，將試劑消耗降低至傳統(tǒng)方法的1/100，操作時(shí)間縮短33%。該技術(shù)通過(guò)精準(zhǔn)操控液滴微環(huán)境，同步實(shí)現(xiàn)表型分析與基因表達(dá)檢測(cè)，為單細(xì)胞研究和高通量篩選提供了革命性工具。
親水-超疏水圖案化表面：DMA玻片通過(guò)硅烷化處理和硫醇-炔點(diǎn)擊化學(xué)，形成1mm2親水斑點(diǎn)（接觸角<10°）與超疏水邊界（接觸角>150°），自發(fā)穩(wěn)定納升液滴（圖1）。
圖1. “芯片上細(xì)胞至cDNA”方法的示意圖。1=在DMA上以微/納升液滴進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和篩選，2=通過(guò)基于顯微鏡的方法進(jìn)行細(xì)胞表型分析，3=使用聚T磁珠進(jìn)行細(xì)胞裂解和mRNA分離，4=在同一液滴內(nèi)將mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA，5=收集cDNA用于定性和定量基因表達(dá)分析。
I.DOT 非接觸式分配技術(shù)：基于氣壓脈沖驅(qū)動(dòng)（75-300 mbar?ms 可調(diào)），實(shí)現(xiàn) 200 nL 液滴的精準(zhǔn)生成，體積誤差 <1%，單細(xì)胞接種成功率> 95%[36,45]。此外，通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)壓力參數(shù)優(yōu)化細(xì)胞存活，150mbar?ms壓力下，HeLa細(xì)胞存活率較75mbar?ms提升42%，避免接觸式移液的機(jī)械損傷[1]。
細(xì)胞培養(yǎng)與表型監(jiān)測(cè)：通過(guò)I.DOT將1-1000個(gè)細(xì)胞/液滴接種至DMA親水斑點(diǎn)，在濕度腔（37°C, 5%CO?）中培養(yǎng)24-48小時(shí)。利用KeyenceBZ-9000顯微鏡實(shí)時(shí)捕獲熒光信號(hào)（如GFP表達(dá)強(qiáng)度），量化表型變化（文獻(xiàn)[1]）。
納升級(jí)分子操作：液滴內(nèi)裂解與mRNA捕獲：I.DOT分配150nLRLT裂解緩沖液，結(jié)合poly-T磁珠（GEHealthcare）實(shí)現(xiàn)mRNA提取，洗脫效率達(dá)92%（傳統(tǒng)試管法75%）。同時(shí)，在200nL體系中加入SuperscriptIV逆轉(zhuǎn)錄酶，通過(guò)濕度腔的熱循環(huán)（65°C退火/52°C合成）完成cDNA合成，PCR擴(kuò)增成功率100%[2,3]。
單細(xì)胞回收效率：單HeLa-GFP細(xì)胞的cDNA經(jīng)qPCR檢測(cè)，Ct值波動(dòng)僅±1.5cycle，回收率達(dá)85%±3%，較傳統(tǒng)試管法（50%±8%）提升70%[1]。
高通量一致性：672液滴同步處理不同濃度阿霉素，mRNA提取與cDNA合成的批次間變異系數(shù)<5%，IC??值與傳統(tǒng)384孔板吻合度>95%（圖2）。
圖2.在液滴微陣列上從總HeLa-CCL2RNA開(kāi)始cDNA合成。A）DNA上cDNA合成的示意性方案。B、C）5μL和D、E）200nL液滴分別在3mm和1mmDMA親水點(diǎn)上的雙視野顯微鏡圖像，B、D）在cDNA合成反應(yīng)之前，C、E）在cDNA合成反應(yīng)之后。比例尺=500μm。F）用從50ngHeLa-CCL2總RNA合成的cDNA進(jìn)行的GAPDHPCR（產(chǎn)物大小=112bp）的凝膠電泳圖像。[Lane編號(hào)1=1kbDNA梯狀條帶，2=無(wú)模板（陰性）對(duì)照，3=在微管中合成的cDNA的PCR產(chǎn)物（陽(yáng)性對(duì)照），4=在3 mmDMA上合成的cDNA的PCR產(chǎn)物，體積為5 μL，5=在1 mmDMA上合成的cDNA的PCR產(chǎn)物，體積為200 nL]。G）用從50ngHeLa-CCL2總RNA合成的cDNA進(jìn)行的ACTBPCR（產(chǎn)物大小=1045bp）的凝膠電泳圖像。凝膠泳道中的樣品序列與圖2F相同。
交叉污染控制：在 3 mm DMA 平臺(tái)的‘Cells-to-cDNA on Chip’流程中（圖 3），I.DOT非接觸式分配使跨液滴污染率<0.01%，顯著低于接觸式移液（1-5%）[3]。
圖3. 液滴微陣列上的“芯片上細(xì)胞到cDNA”方法的詳細(xì)示意性工作流程。RT =室溫。
siRNA干擾效率：液滴內(nèi)轉(zhuǎn)染siGFP（100nM）48小時(shí)后，HeLa-GFP細(xì)胞熒光強(qiáng)度下降90%，qPCR顯示GFP轉(zhuǎn)錄水平降低至88.7%±2.3%，與表型數(shù)據(jù)高度吻合（圖4）。
圖4. 在3mmDMA上用“Cellsto-cDNAonChip”方法對(duì)不同細(xì)胞數(shù)和siRNA介導(dǎo)的靶基因敲除進(jìn)行定性分析和基因表達(dá)定量。A、B）分別為GAPDH（產(chǎn)物大小=112bp）和ACTB（產(chǎn)物大小=1045bp）PCR的凝膠電泳圖像。[Lane編號(hào)1=1kbDNA梯狀條帶，2=無(wú)模板（陰性）對(duì)照，3=使用標(biāo)準(zhǔn)方案在微管中從HeLa-CCL2細(xì)胞合成的cDNA的PCR產(chǎn)物（陽(yáng)性對(duì)照），4=在3mmDMA上從HeLa-CCL2細(xì)胞合成的cDNA的PCR產(chǎn)物，通過(guò)“芯片上細(xì)胞到cDNA”方法]。(C-D)分別在3mmDMA和PCR板上通過(guò)“Cells-to-cDNAonChip”方法從HeLa-CCL2細(xì)胞合成的cDNA的qPCR結(jié)果。C和D的條形圖表示10、100、500和1000個(gè)細(xì)胞的Ct值，每個(gè)重復(fù)5次。誤差條表示平均值土SEM。根據(jù)雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)，*P<0.001，**P<0.01，計(jì)算為連續(xù)組之間的比較。NS=不顯著。在3mmDMA上siGFP轉(zhuǎn)染至HeLa-GFP細(xì)胞的評(píng)估：E-G）熒光顯微鏡圖像分別顯示未轉(zhuǎn)染、亂序siRNA轉(zhuǎn)染和siGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的GFP表達(dá)（轉(zhuǎn)染48小時(shí)后）。比例尺=100μm。H）轉(zhuǎn)染48小時(shí)后HeLa-GFP細(xì)胞中的平均GFP熒光。數(shù)據(jù)表示為來(lái)自3個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。根據(jù)雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)，*P<0.001，**P<0.01。I）在3mmDMA上轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞中GFP轉(zhuǎn)錄物水平的qPCR;通過(guò)“芯片上細(xì)胞至cDNA”方法合成cDNA。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH表達(dá)，并表示為來(lái)自3個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。*P<0.001，如通過(guò)雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算的。
稀有細(xì)胞分析：從10個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）中成功提取mRNA，檢測(cè)到EGFRT790M突變，靈敏度較傳統(tǒng)方法提升10倍[1]。
無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)：在無(wú)Matrigel的DMA表面，hiPSCs培養(yǎng)24小時(shí)存活率達(dá)70%-76%，Nanog蛋白表達(dá)量較傳統(tǒng)培養(yǎng)高1.8倍（P<0.05），證明微尺度環(huán)境可替代動(dòng)物基質(zhì) [4]。
I.DOT通過(guò)納升級(jí)非接觸式分配，解決了傳統(tǒng)移液的交叉污染與機(jī)械損傷問(wèn)題，單細(xì)胞接種誤差<5%，單日可處理超1000樣本，為稀有樣本（如臨床活檢細(xì)胞）的高效利用提供關(guān)鍵工具。從細(xì)胞到cDNA的閉環(huán)操作減少7次樣本轉(zhuǎn)移，使核酸損失降低60%，結(jié)合DMA的透明基底特性，實(shí)現(xiàn)“形態(tài)-基因”雙維度數(shù)據(jù)快速關(guān)聯(lián)[1,2]。
在應(yīng)用場(chǎng)景與轉(zhuǎn)化潛力方面，液滴平臺(tái)在腫瘤藥敏篩選中可同步分析200種化合物對(duì)細(xì)胞凋亡（AnnexinV染色）和Bcl-2通路基因表達(dá)的影響，將周期從2周壓縮至3天；在單細(xì)胞醫(yī)學(xué)前沿，可用于胚胎干細(xì)胞（ESC）的多能性維持研究，通過(guò)I.DOT精準(zhǔn)控制Wnt/β-catenin信號(hào)分子濃度，使Oct4陽(yáng)性細(xì)胞比例提升至92%±2%[4]；在便攜化臨床檢測(cè)方面，結(jié)合便攜式熒光成像模塊，可在床邊對(duì)腫瘤穿刺樣本進(jìn)行當(dāng)場(chǎng)基因分型（如肺癌EGFR突變檢測(cè)），將報(bào)告時(shí)間從3天縮短至6小時(shí)。當(dāng)前技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是需進(jìn)一步優(yōu)化液滴長(zhǎng)期培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給（如動(dòng)態(tài)微流控灌注），并開(kāi)發(fā)AI算法實(shí)現(xiàn)“液滴圖像-基因數(shù)據(jù)”的自動(dòng)化關(guān)聯(lián)分析，未來(lái)隨著I.DOT與光鑷、質(zhì)譜等技術(shù)的融合，DMA平臺(tái)有望成為單細(xì)胞多組學(xué)（基因組+蛋白質(zhì)組）研究的核心工具，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療從“群體統(tǒng)計(jì)”邁向“單細(xì)胞解析”的新維度。
