當前有多種技術可用于體外分子互作檢測，每種技術都存在特定的優(yōu)勢和不足之處，因此，對于特定的分子互作檢測，如何選擇更加合適的技術，是廣大科研人員面臨的一種挑戰(zhàn)。目前諸多方法中，歸納起來，可以分為微流控表面結合法（例如表面等離子共振技術（SPR)或switchSENSE技術）或溶液中檢測法（比如等溫滴定熱分析（ITC）或微尺度熱泳分析（MST））。溶液中檢測法在樣本制備方面存在優(yōu)勢，同時不需要分子固定步驟，操作上更加簡便；而以分子固定為基礎的方法，對樣本的需求量較少，能夠提供底物分子與配體分子解離方面的信息。本文主要是針對switchSENCE技術的介紹及標準操作流程手冊（SOP）中關于核心耗材芯片操作部分介紹，目的是指導儀器操作者深入了解及更加熟練準確的使用該技術。本文內(nèi)容涉及配體偶聯(lián)，芯片介紹及操作。通過對該過程的了解，可以幫助科研人員評估switchSENCE技術是否適用于當前的應用。switchSENSE技術優(yōu)勢體現(xiàn)在微流控芯片上，實現(xiàn)以DNA為基礎的可控的配體分布，允許同時固定兩種不同的配體分子，并可調(diào)節(jié)兩種配體分子的固定比例，實現(xiàn)研究項目的特定需求。該技術可實現(xiàn)多種參數(shù)的表征，比如結合動力學，親和性，酶活性檢測以及蛋白構象變化檢測。

背景介紹

本文關于switchSENSE技術的SOP，其內(nèi)容包括整體SOP的一部分，涉及配體-DNA分子偶聯(lián)原理，芯片處理和操作建議，switchSENSE技術測量的模式。switchSENSE技術的核心為固定在微流控芯片上的DNA納米桿（一段短的DNA核苷酸序列）。芯片上的電極可以驅(qū)動該攜帶有負電荷的DNA納米桿（“switched”)，而通過交叉改變電壓，能夠使得DNA納米桿在電場中產(chǎn)生高頻率的擺動。納米桿的運動軌跡可以通過電驅(qū)動的時間相關的單光子計數(shù)器對DNA分子上連接的熒光探針信號檢測進行實時的捕獲。記錄的熒光信號強度與DNA納米桿相對于芯片表面的位置相關，因為熒光探針一旦接近芯片的金屬表面，由于發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，熒光信號會發(fā)生淬滅。

偶聯(lián)在芯片上的DNA，可以通過與攜帶有配體的互補DNA鏈進行雜交，從而實現(xiàn)芯片的功能化。待測配體-DNA的偶聯(lián)可通過共價偶聯(lián)或芯片表面配體捕獲兩種方式實現(xiàn)。由于該芯片很容易進行再生以及與配對鏈重新雜交，因此同一張芯片可以實現(xiàn)多種分子互作檢測的需求，這也是該技術可用于多種應用的根本原因，比如蛋白-蛋白，蛋白-DNA/RNA互作，小分子結合篩選，親和性檢測，構象檢測，核酸酶活性研究。

分子互作的結合動力學可以在動力模式或靜止模式下進行。在動力模式下，DNA納米桿可經(jīng)電場驅(qū)動產(chǎn)生擺動，底物分子結合參數(shù)可經(jīng)DNA擺動速率進行測量（動力應答）。底物分子一旦與配體結合，DNA納米桿的動力摩擦系數(shù)增加，其運動速率隨之降低（請見Fig. 1）。在擺動速率上的變化，可用于評估動力學變化及親和性參數(shù)（Kon，Koff，Kd)以及蛋白大?。―h）或配體和復合物構象變化。總的來說，動力模式可以提供關于分子結合動力學，蛋白直徑，構象改變，熱溶及熱力學變化，蛋白多聚等；在靜止模式下，DNA在穩(wěn)定的電場中，可保持直立狀態(tài)，底物結合狀態(tài)可通過熒光距離接近感應（FPS）的特性進行檢測。熒光染料分子附近發(fā)生的結合事件將會改變?nèi)玖戏肿痈浇幕瘜W環(huán)境，導致熒光信號發(fā)生改變。靜止狀態(tài)下信號的捕獲與底物分子的大小無關，例如小分子結合動力學檢測。靜止模式下，可以獲取結合動力學，熱溶和熱動力學方面的信息，但是無法獲得蛋白直徑，構象改變信息。此外，與動力模式相比，靜止模式對于芯片的損耗較小，能夠延長芯片的壽命。

另外一種檢測模式被稱為分子尺，基于熒光染料與芯片表面的相對位置而實現(xiàn)，多數(shù)應用于核酸聚合酶活性檢測，以及聚集體/內(nèi)部交聯(lián)檢測。染料的逐步淬滅能夠指示染料的位置信息以及DNA納米桿的移動方向。因此，當聚合酶進行DNA雙鏈合成時，由于熒光探針逐步遠離芯片，能夠?qū)崟r的檢測到熒光信號的增強。

為了對switchSENSE技術測量的分子信息進行分析和理解，對于Helix+設備的專業(yè)了解，生物芯片的質(zhì)量檢測以及實驗的優(yōu)化和設計，都非常重要。因此，對新的儀器使用者提供綜合性的培訓，是十分必要的。

位于德國的Dynamic Biosensors公司提供以swithSENSE技術為基礎的儀器設備，為具備兩個LED光源的DRX2，可以激發(fā)紅色和綠色兩種熒光染料。該SOP適用于雙色DRX2設備，該設備被稱為heliX®，在2020年上市。

雖然配體分子必須與DNA分子提前進行交聯(lián)，才能應用于switchSENSE技術檢測，溶液中檢測的方法不存在特定的樣本制備流程。然而，對于其他方法，目的樣本需要極高的純度和穩(wěn)定性，為了得到可信的動力學數(shù)據(jù)，樣本的存儲濃度需要精確的測量（例如經(jīng)分光光度法）。

heliX®系統(tǒng)與多種緩沖液兼容。推薦使用10mM的鹽溶液以及40mM的添加的單價鹽，PH值為中性，范圍可從5到10。推薦在緩沖液中添加表面活性劑（例如Tween）以及使用0.2um過濾膜進行過濾。當在動力模式下進行測量時，單價鹽離子濃度范圍應從1到300mM（因為電場需要高的離子強度，促進電驅(qū)動的DNA納米桿移動）。熒光測量可在鹽濃度達到3M下進行以及在包含少量的各種細胞裂解液或血清的溶液中進行（可加入EDTA將核酸酶失活）。

Fig. 1 switchSENCE測量的不同模式示意圖

配體-DNA交聯(lián)

該部分介紹了兩種將待測配體固定在芯片表面，使得芯片實現(xiàn)功能化的方法。配體分子首先通過共價連接，儀器純化或者芯片上捕獲的方法與互補配對的DNA納米桿鏈進行交聯(lián)（請見Fig. 2）。通常情況，共價連接法優(yōu)于親和捕獲的方法，原因在于共價連接能夠提供更加穩(wěn)定的配體固定狀態(tài)，防止在解離過程中配體的脫落。但是親和捕獲，不需要復雜的樣本制備，僅需要少量的樣本即可完成捕獲過程。

Fig. 2 配體與配體鏈共價偶聯(lián)示意圖

共價偶聯(lián)

配體蛋白可與單鏈DNA寡核苷酸共價偶聯(lián)，該DNA寡核苷酸可與芯片表面的DNA納米桿進行互補配對。共價偶聯(lián)需要Dynamic Biosensors GmbH提供商品化試劑盒，按照試劑盒標準流程進行操作，提高偶聯(lián)的效率。大多數(shù)的交聯(lián)反應是由氨基或硫醇基介導，普遍認為氨基的偶聯(lián)效率高于硫醇基。如果反應體系中的緩沖液包含伯胺（例如Tris為基礎的緩沖液）或硫醇（例如β巰基乙醇），在對交聯(lián)產(chǎn)物進行下一步處理之前，需要進行緩沖液替換。對于等電點小于6的蛋白，提供經(jīng)優(yōu)化的商品化試劑盒，其中包含可供選擇的交聯(lián)緩沖液。如果交聯(lián)過程需要添加還原劑，推薦使用TCEP（小于1mM）。

交聯(lián)需要的蛋白量推薦為100-200ug，在數(shù)輪的反應后，產(chǎn)生攜帶有配體蛋白的互補核酸鏈。在交聯(lián)過程完成后，通過AKTA或proFIRE純化系統(tǒng)，經(jīng)離子交換層析法去除游離的核酸或過量的蛋白分子。一次switchSENSE測量過程僅需40ul，250nM的配體-核酸交聯(lián)產(chǎn)物。Dynamic Biosensors GmbH為交聯(lián)純化流程提供了完整詳細的操作步驟。

總結說來，互補配對的寡核苷酸鏈和含有交聯(lián)連接子的溶液進行混合，反應完成后，過量的連接子被除去，接著向反應體系中加入待檢測的配體蛋白。交聯(lián)過程可在室溫下進行1h，也可在4攝氏度的條件下過夜反應。后續(xù)使用AKTA或proFIRE純化系統(tǒng)對偶聯(lián)產(chǎn)物進行純化，即將交聯(lián)產(chǎn)物加入到純化儀器中，并由預先準備的不同鹽離子濃度的溶液對純化柱中的產(chǎn)物進行洗脫。收集管可根據(jù)各產(chǎn)物的特性及洗脫時間的差異收集產(chǎn)物，將目的產(chǎn)物與游離的DNA或蛋白區(qū)分開來。該過程同時包含對配體溶液進行質(zhì)量控制的流程。在目的產(chǎn)物被收集管收集后，緩沖液替換成40mM的NaCl溶液，交聯(lián)產(chǎn)物的濃度由物質(zhì)在260nm的吸光值和DNA的消光系數(shù)4,90,000 L mol ?1 cm ?1（48個核苷酸系列）比值共同決定。產(chǎn)物可分裝后保存在-80攝氏度。

親和捕獲

對于芯片表面捕獲法，互補配對鏈可先經(jīng)修飾反應，加上接頭。Dynamic Biosensors GmbH 公司提供一系列的捕獲方法，比如Tris-NTA, streptavidin, Protein A, Protein G, anti-GFP, anti-GST, biotin, digoxigenin以及 strep-tactin。無需樣本制備，修飾的DNA鏈經(jīng)互補配對與芯片雜交，然后通過接頭捕獲待檢測的蛋白分子。

switchSENSE生物芯片

heliX®適配芯片具有一個堅固耐用的單玻璃微流控通道，能夠兼容高流速和腐蝕性化學物質(zhì)。該通道包含兩個測量點，每個測量點都能檢測紅色和綠色熒光信號，從而能夠?qū)崟r參考兩個信號或同時多路復用多達四個信號。該芯片還配備了一個射頻識別標簽，便于輕松追蹤，記錄其狀態(tài)和使用歷史。請見Fig. 3.

Fig. 3  heliX®適配芯片示意圖

以下是對芯片的結構介紹：

1. 錨定鏈為48個寡核苷酸序列，以3'端錨定在芯片表面；

2. 適配體鏈可根據(jù)實驗需求進行定制，其范圍從標準的 96 個核苷酸序列或任何類型的 DNA 和/或 RNA 序列，到復雜的結構，例如用于研究大型分子復合物構象變化的 DNA 折紙結構或用于研究雙特異性分析物的超分子 DNA Y 結構。適配體鏈的下半部分與芯片表面的錨定鏈互補——用于檢測點的適配體鏈1和用于檢測點2的適配體鏈2，從而實現(xiàn)芯片的功能化。在適配體鏈的3'端連接的熒光染料，從多種化學性質(zhì)各異的染料中選擇，能夠?qū)崿F(xiàn)信號檢測。標準的紅色和綠色染料（Ra 和 Ga）經(jīng)過優(yōu)化，適用于 switchSENSE® 測量，并且與大多數(shù)實驗設置兼容，而另外四種染料（Rb、Rc、Gb 和 Gc）可用于根據(jù)不同的化學性質(zhì)優(yōu)化信號檢測；

3. 配體鏈是一種可替換的48個核苷酸的鏈，它既可以攜帶感興趣的配體，也可以在實時實驗中作為不含配體的對照。感興趣的分子可以通過上述介紹的共價偶聯(lián)或標簽捕獲法實現(xiàn)。芯片結構請參考Fig. 4

Fig. 4 芯片檢測點整體結構示意圖

switchSENSE生物芯片的測試和操作流程

在開始實驗前，必須運行 heliX® 適配器芯片測試，以評估芯片的質(zhì)量和是否適合實驗。實驗結束后進行芯片測試，以評估其狀況并確保正確儲存（以保持DNA雙鏈形式且不附著配體）。為獲得一致且可靠的結果，應在標準化條件下進行芯片測試：在 25°C 的維護緩沖液（TE40）中，測試和備用溶液中含預先雜交的適配鏈1和2以及無配體鏈。

芯片測試的工作流程

芯片測試的工作流程由四個連續(xù)的步驟組成——（1）再生，（2）鈍化，（3）表面功能化以及（4）狀態(tài)測量。

1. 再生過程是通過使用再生溶液使雙鏈DNA納米桿變性來實現(xiàn)的，這樣單鏈DNA錨定鏈仍附著在芯片電極表面；

2. 在鈍化步驟中，芯片表面會用含硫醇的鈍化溶液進行處理。此過程在芯片表面形成一層自組裝單分子層，可防止非特異性結合并延長芯片的使用壽命；

3. 表面功能化為適配體1-Ra-lfs 和適配體2-Ra-lfs 序列，分別與錨定1和錨定2雜交（請見Fig. 5)。

Fig. 5 芯片測試示意圖

然后，芯片會在維護緩沖液（TE40）中接受兩步狀態(tài)測量，包括電壓校準和動態(tài)響應測量。

電壓校準提供了關鍵信息，即有效驅(qū)動 DNA 納米杠桿所需的最敏感電壓切換范圍。這是通過施加不同的電壓并在每個步驟記錄熒光信號來實現(xiàn)的。在足夠負的電壓下，帶負電荷的 DNA 納米杠桿完全從表面排斥。隨著電壓向更正值轉(zhuǎn)變，觀察到S型信號下降，這反映了 DNA 納米杠桿逐漸接近淬滅的金表面。此過程的關鍵讀數(shù)是DNA納米杠桿向下運動的拐點（見下圖IP），該拐點用于選擇后續(xù)動態(tài)響應測量的最佳電壓范圍。在對功能適配器芯片進行測試時，軟件會在兩個紅色通道（R1 和 R2）中識別拐點。拐點應在 -50 mV 至 400 mV 的范圍內(nèi)。如果未檢測到拐點，軟件將直接從分析中提供故障排除選項以幫助解決問題。

Fig. 6 芯片測試信號示意圖

接下來進行動態(tài)響應測量，在此過程中，DNA 納米杠桿在維持緩沖液（TE40）中通過交替電壓進行驅(qū)動。比IP更正的電壓會將 DNA 納米杠桿吸引向淬滅金表面，導致末端連接的熒光團發(fā)出的熒光信號降低。相反，比IP更負的電壓會將納米杠桿從表面推開，從而產(chǎn)生較高的熒光信號。這些數(shù)據(jù)用于確定兩個電極的開關幅度（相對幅度，以百分比表示）。功能正常的適配器芯片的相對幅度應大于 40%（如表 1 所示）。

表1. 功能性 heliX® 適配器芯片的狀態(tài)參數(shù)：

在 heliOS軟件中設置芯片測試

1. 點擊如Fig. 7所示的圖標打開分析；

2. 選擇“新建”以創(chuàng)建新的檢測工作流程；

3. 重命名新的檢測工作流程（例如，CT ID XXX）并確認更改；

提示輸入您的芯片 ID 作為檢測名稱，以便將您的芯片測試數(shù)據(jù)與相應的芯片關聯(lián)起來；

4. 點擊軟件圖標進行保存；

5. 點擊（+）圖標添加新的檢測方法；

 Fig. 7 軟件中建立芯片檢測實驗

6. 轉(zhuǎn)到“檢測”并選擇“芯片測試”；

7. 點擊“添加檢測”以確認，此時默認的芯片測試檢測方法將自動打開；

8. 通過打開“芯片”下拉菜單選擇相應的芯片位置（默認位置 1）。如果芯片測試是系列實驗的一部分，且需要不同條件（例如PE140、TE140 等），您還可以選擇不同的運行緩沖液。但請注意，芯片測試始終在維護緩沖液（TE40）中進行；

9. 點擊樣品托盤按鈕（燒瓶圖標）以預覽樣品和緩沖液的位置；

10. 彈出樣品托盤，按照軟件提示放置小瓶，即再生溶液置于（1）位，測試和備用溶液置于（2）位，10毫升去離子水瓶（無蓋）置于（A）位，10 毫升鈍化溶液瓶（有蓋）置于（B）位；

11. 點擊“運行”按鈕，分析啟動向?qū)⒋蜷_。按照提示順序操作，直到可以點擊“開始分析”。

Fig. 8 芯片檢測中軟件自動實驗流程圖

heliOS 中的芯片測試評估

heliOS 提供了自動的 heliX® 適配器芯片測試分析功能，旨在快速評估您的芯片質(zhì)量。要分析芯片測試的結果，只需在實驗文件底部選擇“分析”，然后在自動分析向?qū)е羞x擇 heliX 適配器芯片測試作為分析類型即可。

 Fig. 9 芯片檢測結果軟件分析界面

該分析包含四項自動質(zhì)量檢查，用于評估芯片測試（請參見下面的示例，其中淺藍色軌跡代表檢測點1，深藍色軌跡代表檢測點2）：

1. 配體注入：這確保了配體注入能產(chǎn)生預期的熒光增強（上圖）。它還允許通過熒光振幅隨時間的變化（下圖）直觀評估來自測試溶液和備用溶液的互補鏈與固定錨點的雜交動力學；

2. 拐點：這會驗證在電壓校準期間是否識別出兩個點的拐點；

3. 相對振幅：這決定了兩個點（僅在紅色通道中）的相對振幅是否超過功能正常的 heliX® 適配芯片所指定的閾值，如虛線所示；

4. 參數(shù)：這確保了可以從嵌入芯片中的射頻識別標簽讀取關鍵信息（例如：芯片ID、再生次數(shù)和芯片有效期）。

Fig. 10 芯片測試結果示意圖

switchSENSE技術在三元復合物

及雙特異性抗體檢測中的獨特應用

由于該技術基于操控性強的核酸鏈，并具備雙色檢測系統(tǒng)，因此可用于三元復合物互作檢測，比如PROTAC分子，雙特異性抗體操作，請見以下示意圖：

Fig. 11 三元復合物檢測示意圖

通過Fig. 11可知，可在芯片上設置“Y”型結構，將兩種配體分別與“Y”型兩臂偶聯(lián)，將底物分子，比如PROTAC分子，雙特異性抗體等與兩配體進行結合。檢測的原理為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），如果形成三元復合物，綠色熒光的能量將會轉(zhuǎn)移到紅色熒光，紅色熒光被激發(fā)后，經(jīng)檢測器檢測到信號。通過該種設計，可以在同一張芯片上，一次實驗設計中，同時檢測二元結合和三元結合，并可分析雙抗原之間對配體結合親和性的互相影響關系。

本文介紹了switchSENSE技術SOP中部分內(nèi)容，旨在幫助研究人員了解該技術原理，為實驗需求選擇更加適合的技術。

同騰睿杰（上海）生物科技有限公司作為Bruker Dynamic Biosensors中國總代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的售前售后服務。

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