傳統(tǒng)藥物開(kāi)發(fā)中，化合物庫(kù)合成與生物篩選面臨“高成本、低通量、長(zhǎng)周期”的三重挑戰(zhàn)，單藥研發(fā)成本超20億美元，且96孔板等傳統(tǒng)平臺(tái)難以滿足微量樣本的高效利用需求[1,2]。德國(guó)卡爾斯魯厄理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)聯(lián)合I.DOT非接觸式液滴分配技術(shù)，推出光控釋放液滴微陣列（DMA）平臺(tái)，首次實(shí)現(xiàn)從納摩爾級(jí)固相合成到活細(xì)胞篩選的全流程集成。該平臺(tái)通過(guò)I.DOT精準(zhǔn)操控100nL級(jí)液滴反應(yīng)單元，結(jié)合UV觸發(fā)化合物釋放機(jī)制，將試劑消耗降低至傳統(tǒng)方法的1/1000，為高通量藥物發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟全新路徑。
納米多孔聚合物涂層：在玻璃基底制備12μm厚HEMA-EDMA聚合物層，通過(guò)硫醇-炔點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建親水（接觸角4.4°）/超疏水（接觸角170°）圖案，形成3mm圓形（5μL）或1mm方形（100nL）液滴陣列（圖1）。I.DOT技術(shù)通過(guò)氣壓脈沖（75-300mbar?ms）實(shí)現(xiàn)非接觸式液滴生成，體積誤差<1%，單細(xì)胞接種成功率>95%。
圖1. 液滴微陣列平臺(tái)結(jié)合高通量固相合成和基于細(xì)胞的篩選。A）多孔聚甲基丙烯酸酯薄膜（12 μm）用氟烷基和半胱胺部分官能化以分別產(chǎn)生SH和反應(yīng)性HL區(qū)域。UV-可切割的連接體（羥乙基光連接體，HEPL）共價(jià)固定在HL斑點(diǎn)中，形成后續(xù)固相組合合成的基礎(chǔ)。B）顯示可能的基于細(xì)胞的篩選順序的方案：合成的化合物可以通過(guò)在365 nm下的UV照射ii）釋放到在HL斑點(diǎn)中形成的不同納米液滴中，以在生物測(cè)定（i）中篩選或分析，例如，通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法（iv），隨后進(jìn)行純化步驟
UV 可裂解連接劑錨定：將羥基乙基光連接劑（HEPL）通過(guò)酯鍵固定于親水斑點(diǎn)，其硝基基團(tuán)在 365 nm UV 光下可快速還原為亞硝基，釋放共價(jià)結(jié)合的化合物（圖2）。
圖2. A）將CHL附著到HEPL上，隨后在UV-照射下釋放，在表面上留下裂解的光致連接物（c-HEPL）。B）通過(guò)對(duì)不同照射時(shí)間后的溶液進(jìn)行光譜分析，確定了作為模型藥物的CHL從表面釋放到5μL液滴中的UV觸發(fā)動(dòng)力學(xué)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。C）通過(guò)UV光對(duì)HEPL裂解的空間控制。在接頭裂解期間，顯黃色。制備液滴微陣列，并在通過(guò)光掩模照射之前在所有HL斑點(diǎn)中用HEPL修飾。頂部圖案：2688個(gè)正方形斑點(diǎn)，邊長(zhǎng)500 μm，邊框250 μm。使用“KIT Levkin Lab”徽標(biāo)作為倒置光掩模。底部圖案：以棋盤(pán)圖案照射80個(gè)直徑為3 mm的圓點(diǎn)。UV連接體HEPL可完全控制化合物的空間釋放。
組合化學(xué)高通量合成：利用I.DOT的高通量分配能力，在1 mm方形斑點(diǎn)中依次分配30 nL胺溶液、35 nL羧酸溶液和40 nL異氰化物溶液（0.5MGBL體系），通過(guò)非接觸式打印避免交叉污染。5種表面錨定氨基酸、3種異氰化物、7種羧酸和8種羰基化合物組合，理論生成840種雙酰胺產(chǎn)物（圖3）。
圖3. Ugi四組分反應(yīng)的示意圖，具有表面錨定的胺（1-5）、羧酸（9-15）、醛或酮（16-23）和異氰化物（6-8）以及形成的雙酰胺（產(chǎn)物24-36）的可變條目。底部：固相化學(xué)的詳細(xì)表示。連接到聚合物層的每個(gè)4-戊炔酸充當(dāng)分支點(diǎn)并帶有兩個(gè)連接分子，有效地使反應(yīng)位點(diǎn)的總數(shù)加倍。
自動(dòng)化流程整合：I.DOT與MALDI-TOF聯(lián)用，通過(guò)三明治轉(zhuǎn)移技術(shù)將液滴產(chǎn)物復(fù)制到ITO玻片，實(shí)現(xiàn)高通量質(zhì)譜表征（圖4）。
圖4.將微滴微陣列復(fù)制到ITO載玻片上用于MALDI-TOFMS測(cè)量的過(guò)程。A）定位裝置有助于將兩個(gè)載玻片彼此對(duì)準(zhǔn)。左側(cè)是具有經(jīng)照射的液滴微陣列的底部部分，而右側(cè)是具有ITO載玻片（已經(jīng)壓印有基質(zhì)）的頂部部分。B）封閉式密封裝置。兩側(cè)的兩個(gè)連接器將兩半拉在一起，而距離由四個(gè)螺釘控制。降低頂部，直到所有液滴接觸ITO載玻片。C）干燥DMA（14×141 mm HL點(diǎn)，頂部）、每個(gè)點(diǎn)中具有100 nL水的DMA（中間）和UV照射后的干燥陣列（底部）的合并照片。D）復(fù)制液滴中含有基質(zhì)混合物（CHCA/DHB）的液滴微陣列并真空干燥后的ITO載玻片。E）作為鈉加合物的化合物37的MALDI-TOF光譜（[M+Na]+，檢測(cè)：717.55m/z，計(jì)算：717.38u）和F）基質(zhì)背景。首先通過(guò)UV照射將化合物切割成不同的液滴，然后向每個(gè)斑點(diǎn)中加入100 nL CHCA和DHB基質(zhì)在10% ACN/水（含有5×10?3M HCl）中的飽和溶液，并將DMA載玻片固定在ITO載玻片上以復(fù)制陣列。將ITO載玻片真空干燥并通過(guò)MALDI-MS分析。
I.DOT 細(xì)胞接種與活性檢測(cè)：以氯ambucil（CHL）為模型藥，I.DOT將CHO-K1細(xì)胞（1×10?cells/mL）精準(zhǔn)接種至DMA斑點(diǎn)，UV照射（2.5 mW/cm2，15 min）觸發(fā)CHL釋放，通過(guò)Calcein-AM/PI染色評(píng)估細(xì)胞活力。
圖5. 將CHO-K1細(xì)胞接種在DMA上，并在孵育24小時(shí)后，通過(guò)鈣黃綠素AM/PI染色不同處理的表面來(lái)測(cè)定其活力。活力不受紫外光或固定化CHL的存在下。細(xì)胞活力僅在用附著的CHL照射表面后降低，這導(dǎo)致藥物釋放到液滴中。每個(gè)柱代表同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。
時(shí)空精準(zhǔn)調(diào)控：I.DOT配合光掩模實(shí)現(xiàn)區(qū)域選擇性釋放，如“KIT” logo圖案化釋放驗(yàn)證空間控制精度（圖2C）；CHL釋放動(dòng)力學(xué)顯示，15分鐘內(nèi)可達(dá)最大濃度954 μM（圖2B），滿足細(xì)胞篩選的劑量需求。
細(xì)胞水平驗(yàn)證：UV觸發(fā)CHL釋放后，CHO-K1細(xì)胞存活率從97%降至3%，而未照射組或無(wú)藥組存活率無(wú)顯著變化，證明I.DOT構(gòu)建的微環(huán)境可精準(zhǔn)模擬藥物-細(xì)胞互作。
微型化優(yōu)勢(shì)：1 mm方形斑點(diǎn)較3 mm圓形斑點(diǎn)，單位面積反應(yīng)密度提升7.5倍（30spots/cm2），單玻片可構(gòu)建588種化合物庫(kù)，較96孔板通量提升6倍。I.DOT的非接觸式分配使試劑消耗從20 μL/樣本降至100nL/樣本，成本降低99%。
產(chǎn)物多樣性與純度：13種代表性產(chǎn)物純度21%-91%（LC-MS分析），MALDI-TOF驗(yàn)證顯示I.DOT輔助合成的化合物結(jié)構(gòu)一致性達(dá)95%以上。
I.DOT驅(qū)動(dòng)的技術(shù)革新展現(xiàn)出顯著的核心技術(shù)價(jià)值，其非接觸式分配與DMA光控釋放結(jié)合，實(shí)現(xiàn)“合成-釋放-篩選”全流程自動(dòng)化閉環(huán)，較傳統(tǒng)多平臺(tái)操作減少7次樣本轉(zhuǎn)移，誤差降低80%，且支持單日處理超1000樣本，單細(xì)胞cDNA回收率達(dá)85%，平衡了高通量與低耗需求。在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，可用于腫瘤藥敏個(gè)性化篩選，48小時(shí)內(nèi)完成評(píng)估，周期縮短70%，還能精準(zhǔn)控制信號(hào)分子濃度以維持胚胎干細(xì)胞多能性，未來(lái)將開(kāi)發(fā)亞微米級(jí)斑點(diǎn)提升庫(kù)容量至10?級(jí)，并集成微流控灌注系統(tǒng)模擬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。
1. J. A. DiMasi, H. G. Grabowski, R. W. Hansen, J. Health Econ. 2016, 47, 20.
2. H. E. Blackwell, Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 203.
