蛋白會經(jīng)歷各種翻譯后修飾（PTMs). 這些修飾能夠使得蛋白的活性，定位，相互作用和穩(wěn)定性得到非常精細(xì)的調(diào)節(jié)。與蛋白的磷酸化具有相似的復(fù)雜性和重要性，賴氨酸殘基的ε-amine的乙酰化，成為最普遍存在的蛋白翻譯后修飾的一種。賴氨酸乙酰化是由賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶（KATs)誘導(dǎo)，由去乙酰化轉(zhuǎn)移酶(KDACs）去除乙酰化。除了乙酰基之外，還可以添加和移除更長的酰基鏈，包括丙酰基、丁酰基和肉豆蔻酰基，或者由二羧酸（如丙二酸、琥珀酸或谷氨酸酸）衍生出的酰基團(tuán)，上述的賴氨酸修飾酶能夠完成這一過程。

人類的基因組中已鑒定出18種不同的KDACs，根據(jù)它們的序列同源性分成四組。Sirtuins, 屬于第三類KDACs,是KDAC家族中比較特殊的成員。雖然一類，二類和四類去乙酰化酶是Zn2+依賴的金屬蛋白酶型的去乙酰化酶，但是7種人的sirtuins亞型為NAD+依賴的催化機(jī)制。在催化反應(yīng)過程中，sirtuins會經(jīng)歷一種構(gòu)象變化過程，從無酶活的“開放構(gòu)象”轉(zhuǎn)變?yōu)椋伲┑孜锝Y(jié)合態(tài)的“封閉構(gòu)象”。Sirt2亞型主要位于細(xì)胞質(zhì)，能夠?qū)⒍喾N底物去乙酰化，例如α-tubulin, BubR1, p53, eIF5A和NFκB。Sirt2依賴的去乙酰化對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，自噬，周緣髓鞘化和免疫及炎癥應(yīng)答存在主要的影響。除了去乙酰化，Sirt2也催化長鏈脂肪酸的去除。然而，越來越多的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Sirt2的總體細(xì)胞作用機(jī)制不僅僅依賴于催化活性，也依賴于蛋白和蛋白之間的相互作用，比如KDA6或TTTP/p25。

Sirt2的功能失調(diào)和多種疾病的發(fā)生相關(guān)，包括細(xì)菌感染，類型II糖尿病，神經(jīng)退行性疾病和腫瘤，提示Sirt2有希望成為一個(gè)藥物干預(yù)的靶點(diǎn)。然而，對于一些疾病，包括亨廷頓氏病以及一些類型的腫瘤，還未最終被明確Sirt2是被上調(diào)，還是被下調(diào)或者被抑制，進(jìn)而改善特定的疾病狀態(tài)。由于迫切需要合適的工具化合物來進(jìn)一步研究 Sirt2 去乙酰化對細(xì)胞的影響，并驗(yàn)證 Sirt2 作為藥物靶點(diǎn)的潛力，因此人們發(fā)現(xiàn)了多種具有藥物特性的 Sirt2 選擇性小分子抑制劑。最近，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一類新的Sirt2高度選擇性抑制劑（請見Figure 1A).這些化合物在較低的uM到nM濃度范圍內(nèi)抑制Sirt2, 然而對于它的相近的同源物Sirt1和Sirt3卻沒有檢測到抑制效應(yīng)（IC50>100uM)。

Sirt2與1或2結(jié)合形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（請見Figure 1A）是 Sirt2與特異性Sirt2 抑制劑結(jié)合的首個(gè)晶體結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)表明抑制發(fā)生的特定模式，一旦配體結(jié)合，Sirt2的激活位點(diǎn)會出現(xiàn)重大改變（請見Figure 1B)。由于激活位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)重排，鉸鏈區(qū)的兩個(gè)環(huán)會形成一個(gè)新的結(jié)合口袋，該結(jié)合口袋將羅森曼折疊域與鋅離子結(jié)合域連接了起來。這種現(xiàn)象僅在Sirt2中被觀察到，并且其原因歸結(jié)于Sirt2在活性位點(diǎn)這一特定區(qū)域所具有的獨(dú)特靈活性。因此這種類型的抑制劑被稱為Sirtuin重排配體（SirReals），形成的誘導(dǎo)-契合結(jié)合口袋被稱為選擇性位點(diǎn)。因?yàn)榻?jīng)鑒定，它是Sirt2選擇性的關(guān)鍵。在我們發(fā)現(xiàn)Sirt2的選擇性口袋存在的不久后，研究結(jié)果表明，這個(gè)小囊腔能夠容納一種名為“肉豆蔻酰基”底物的長鏈脂肪酸。同時(shí)，其他 Sirt2 抑制劑通過與選擇性凹槽結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)了其亞型選擇性。

因此，我們的目的是研究SirReal-Sirt2相互作用的結(jié)合動力學(xué)。最初嘗試?yán)肐TC檢測結(jié)合和解離動力學(xué)，但未能成功，這可能與以下事實(shí)有關(guān)：結(jié)合焓值被與重排過程相關(guān)的能量貢獻(xiàn)所掩蓋了。因此，我們將一個(gè)經(jīng)丙炔基化處理的 SirReal 類似物與一個(gè)氨基官能化的生物素進(jìn)行連接，從而得到了一種具有三唑連接的源自 SirReal 的親和探針。該探針在BLI中用于結(jié)合動力學(xué)研究。我們的動力學(xué)結(jié)果顯示一個(gè)非常慢的解離動力學(xué)（請見Figure 1C)，表明Sirt2在配體結(jié)合后，Sirt2的活性位點(diǎn)確實(shí)捕獲了SirReal,導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生適應(yīng)性改變。這導(dǎo)致了配體在靶點(diǎn)上的較長的滯留時(shí)間（例如配體-復(fù)合物的半衰期）以及造成的慢的解離（請見Figure 1C).然而，Sirt2與基于三唑的 SirReal 形成的復(fù)合物的共晶體結(jié)構(gòu)表明，三唑部分，在標(biāo)記過程中，做為連接部分被引入，也涉及到通過特定的方式與Sirt2相結(jié)合。三唑部分與共因子結(jié)合環(huán)的第97位精氨酸形成氫鍵（請見Figure 1B).為了闡明，Sirt2的親和探針較長的結(jié)合時(shí)間是由于三唑部分引入引起的，還是僅僅由于SirReal的結(jié)合，我們需要尋找一種新的技術(shù)，通過無標(biāo)記技術(shù)檢測該結(jié)合動力學(xué)。

SirReal與Sirt2的結(jié)合動力學(xué)

為了通過配體無標(biāo)記法研究Sirt2-SirReal結(jié)合動力學(xué)（Kon, Koff常數(shù)），我們利用了以DNA納米桿為特征的switchSENCE技術(shù)。該方法具有較高的靈敏度，用以檢測未標(biāo)記的小分子和表面偶聯(lián)蛋白的相互作用。在我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，Sirt2經(jīng)共價(jià)偶聯(lián)到短的雙鏈DNA納米桿的一條鏈上，該DNA納米桿與金屬微電極連接。另一條鏈?zhǔn)褂脽晒馊玖蠘?biāo)記，本文使用的是Cy3（請見Figure 2A).通常，該設(shè)計(jì)可通過兩種模式測量。在靜止模式下，配體與DNA納米桿上的蛋白相互作用直接通過DNA納米桿上的熒光信號發(fā)射進(jìn)行表征。然而，值得提到的是，如果結(jié)合不能夠直接影響與DNA連接的熒光探針的熒光特性，就無法利用該模式檢測。在SirReal-Sirt2相互作用下，靜止模式的測量未能產(chǎn)生任何結(jié)合數(shù)據(jù)可以用于進(jìn)一步分析。因此，我們使用了動力學(xué)模式，檢測SirReal-Sirt2的相互作用。switchSENCE技術(shù)在金屬電極表面產(chǎn)生正負(fù)交替變換的電壓，能夠吸引或排斥雙鏈DNA帶有負(fù)電荷的骨架。這使得DNA納米桿產(chǎn)生了一個(gè)方向上的擺動，被稱為“switching”。由于存在一種與距離相關(guān)的無輻射能量傳遞方式，使得染料所發(fā)出的熒光光強(qiáng)能夠反映其與金表面的距離。換句話說，熒光團(tuán)與猝滅金表面的距離越近，發(fā)出的光就越少。改變偶聯(lián)蛋白的流體摩擦力的過程（比如配體結(jié)合，構(gòu)象重構(gòu)，熱變性）都會影響DNA運(yùn)動的速度，這導(dǎo)致在擺動的動力學(xué)上發(fā)生變化。

在進(jìn)行動力學(xué)測量之前，我們想要闡明，固定的過程是否會影響Sirt2結(jié)構(gòu)的完整性以及配體結(jié)合的性能。因此，我們在SirReal2存在和不存在時(shí)，分別測量了偶聯(lián)的Sirt2的熱穩(wěn)定性（請見Figure 2B).通過 SirReal2對Sirt2 進(jìn)行的固定化處理，即使是在低微摩爾濃度的配體存在下，也能實(shí)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性，這表明其折疊狀態(tài)良好且具有有效的配體結(jié)合特性。附著的Sirt2的熱穩(wěn)定性與濃度和時(shí)間均相關(guān)（請見Figure 2B)。

需要注意的是，通過switchSENCE技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)，在配體濃度為3.3-10uM之間，出現(xiàn)了顯著的熱轉(zhuǎn)移（?T ~ 3 °C）。使用結(jié)合到附著的Sirt2上的SYPRO熒光染料進(jìn)行熒光熱轉(zhuǎn)移檢測，僅僅在25uM的高配體濃度下可檢測到相似的熱轉(zhuǎn)移（?T ~ 3 °C）。

根據(jù)熱穩(wěn)定檢測結(jié)果，我們在配體濃度為2-20uM之間，檢測動力學(xué)。通過采用 switchSENSE® 技術(shù)（動態(tài)模式），我們觀察到未標(biāo)記的 SirReal2從固定化的 Sirt2 上發(fā)生了非常緩慢的解離（請見Figure 2C）。此外，對不同濃度的SirReal2(2.2uM-20uM), 我們獲得了該相互作用的結(jié)合常數(shù) kon ，解離常數(shù) koff 以及 K d 值，其數(shù)值與之前報(bào)道的 Sirt2與我們所使用的標(biāo)記并固定化的 SirReal 基質(zhì)親和探針之間相互作用的數(shù)據(jù)在范圍上高度相似（kon = 6.9 ± 0.22 × 10 3 M-1 s-1 , koff = 7.0 ± 0.31 × 10 -4 s-1 , K d = 0.10 μM)。通過對記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們得到了相互作用的常數(shù)kon =7.7 ± 0.2 × 10 2 M-1 s-1 , koff = 4.1 ± 0.1 × 10 -4 s-1。該數(shù)據(jù)為我們提供了總的解離常數(shù)Kd=Koff/Kon=0.53±0.02uM. 這個(gè)K d 值與已報(bào)道的 SirReal2 的 IC 50值高度一致，IC50值為0.44uM。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SirReals較長的結(jié)合時(shí)間是配體本身的特性決定，并非是由于三唑與第97位精氨酸形成的H-鍵的相互作用引起，我們利用 switchSENSE® 技術(shù)確定了含三唑結(jié)構(gòu)的 SirReal 類似物 5 的動力學(xué)參數(shù)。獲得的Koff常數(shù)為7.9 ± 0.6 ×10 -4 s -1 ，與含三唑結(jié)構(gòu)的 SirReal的親和探針獲得的Koff較一致koff = 7.0 ± 0.31 × 10 -4 s-1，以及與由BLI和switchSENCE測得的SirReal2結(jié)合常數(shù)4.1 ± 0.1 × 10 -4 s-1也較一致。因此我們能夠表明，SirReal-Sirt2相互作用較長的結(jié)合時(shí)間是來自于SirReal本身的特性，既不是三唑結(jié)構(gòu)引入的結(jié)果，也不是測量技術(shù)的偏差。

無標(biāo)記switchSENCE技術(shù)檢測SirReal2與Sirt2結(jié)合動力學(xué)