本研究采用CHO-K1和CHO-S單克隆抗體表達細胞系作為模型，比較了傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和C.BIRD?培養(yǎng)方法對細胞生長的影響。細胞在無血清、化學(xué)成分定義的CD Hybridoma培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用標(biāo)準(zhǔn)的24孔板進行C.BIRD和靜態(tài)培養(yǎng)，每個孔的總體積為1400 μL。搖瓶培養(yǎng)則在130 rpm的軌道搖床中進行，總體積為30 mL。所有細胞和C.BIRD設(shè)備在37°C、5% CO2水套培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3天。使用細胞計數(shù)器（Bio-Rad, TC20）計數(shù)細胞數(shù)量和活率。每天的細胞數(shù)在同一板的不同孔中獨立測量，以避免細胞培養(yǎng)過程中額外的擾動。細胞計數(shù)后，每孔補充與細胞計數(shù)相同量的培養(yǎng)基，在隨后的幾天內(nèi)不再測量。蛋白產(chǎn)量通過ELISA試劑盒（Bethyl Lab, E88-104）測量。統(tǒng)計學(xué)采用單因素方差分析。

實驗設(shè)計由圖1所示，在靜態(tài)培養(yǎng)、C.BIRD培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)中測定CHO-K1及CHO-S單克隆抗體(mAb)細胞株的總細胞密度、活細胞密度、倍增時間及蛋白產(chǎn)量。CHO-K1的初始接種密度為0.33×10⁶個細胞/mL，CHO-S的初始接種密度為0.5×10⁶個/mL，每天三次測量各組總細胞密度和活細胞密度，為期3天。

圖1. 實驗設(shè)計示意圖。比較三種不同的細胞培養(yǎng)方法。這些組的測量提供了不同培養(yǎng)環(huán)境下的單個細胞概況

1、 實驗結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD?培養(yǎng)的CHO-K1細胞在第3天的活細胞密度和總細胞密度顯著提高。C.BIRD組的平均活細胞密度和總細胞密度分別達到2.87×10^6 cells/mL和3.06×10^6 cells/mL，均顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(圖2A和2B)。表明C.BIRD?培養(yǎng)方法在24孔板中改善了細胞培養(yǎng)環(huán)境，提供了更高的承載能力。

2、C.BIRD組顯著縮短了CHO-K1細胞的平均倍增時間，從35小時縮短到24小時，與搖瓶培養(yǎng)組的23小時相比，沒有顯著差異（圖2C）。這表明C.BIRD?方法提高了CHO-K1細胞的增殖率，并在實驗的早期階段提供了與搖瓶培養(yǎng)相似的細胞增殖特性。而在蛋白產(chǎn)量方面，C.BIRD組的蛋白產(chǎn)量與搖瓶培養(yǎng)組相當(dāng)，幾乎是靜態(tài)組的4倍（圖2D）。這表明C.BIRD?方法在24孔標(biāo)準(zhǔn)板上能夠篩選出具有高一致性的細胞特征，這些特征在CLD過程的后期階段得以保持。

圖2. A和B：3組的日活細胞/總細胞密度:24孔板靜態(tài)培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和24孔板C.BIRD培養(yǎng)。C：3組在第3天的倍增時間。D：3組在第3天蛋白質(zhì)產(chǎn)量。統(tǒng)計學(xué)采用單因素方差分析，P值的顯著性分別為:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。數(shù)據(jù)以mean±SD表示。

3、與傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD?培養(yǎng)的CHO-S細胞在第3天的活細胞密度和總細胞密度顯著提高。C.BIRD組的平均活細胞密度和總細胞密度分別達到2.67×10^6 cells/mL和3.03×10^6 cells/mL，均顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(圖3A和3B)。此外，與靜態(tài)組相比，C.BIRD組顯著縮短了CHO-S細胞在第3天的平均倍增時間，從42.43小時縮短至29.77小時(圖3C)。這些結(jié)果表明，C.BIRD方法比靜態(tài)方法更能有效地提高CHO-S細胞在實驗早期的細胞增殖率。

4、在蛋白產(chǎn)量方面，C.BIRD懸浮培養(yǎng)細胞產(chǎn)生17.01μg/mL mAb，而靜態(tài)培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)細胞產(chǎn)生10.22和21.11μg/mL mAb。與靜態(tài)培養(yǎng)法相比，24孔標(biāo)準(zhǔn)板上的C.BIRD方法可以提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。C.BIRD和搖瓶培養(yǎng)方法之間較高的蛋白產(chǎn)量一致性有效地支持了在CLD過程后期篩選細胞譜具有高一致性的理想克隆。

圖3. A和B：3組的日活細胞/總細胞密度:24孔板靜態(tài)培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和24孔板C.BIRD培養(yǎng)。C：3組在第3天的倍增時間。D：3組在第3天蛋白質(zhì)產(chǎn)量。統(tǒng)計學(xué)采用單因素方差分析，P值的顯著性分別為:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。數(shù)據(jù)以mean±SD表示。