我們的研究表明，用于細(xì)胞系開(kāi)發(fā)的 C.BIRD? 微生物反應(yīng)器能夠改善 96 孔培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并且在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和蛋白質(zhì)產(chǎn)量方面與搖瓶培養(yǎng)數(shù)據(jù)極為相似。
傳統(tǒng)的細(xì)胞系開(kāi)發(fā)（CLD）流程由于早期和后期開(kāi)發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞系特征不一致，需要花費(fèi)大量時(shí)間才能找到最優(yōu)克隆。C.BIRD 系統(tǒng)是一種新的細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)新技術(shù)，通過(guò)減少兩個(gè)階段之間的細(xì)胞特征差異，并在 CLD 流程的早期提供最佳懸浮培養(yǎng)條件，解決了這一問(wèn)題。在本研究中，我們使用 C.BIRD 系統(tǒng)和不使用 C.BIRD 系統(tǒng)培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系，并比較了生成的細(xì)胞特征與在搖瓶培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞特征之間的差異。結(jié)果表明，C.BIRD 提高了活細(xì)胞/總細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力，并且與大規(guī)模搖瓶培養(yǎng)具有出色的可比性。此外，細(xì)胞倍增時(shí)間和相對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量都有顯著提高，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異。
生物制藥行業(yè)正在呼吁加快細(xì)胞系開(kāi)發(fā)（CLD）流程，以便新生物制品能夠更快獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。然而，傳統(tǒng)的 CLD 流程可能需要數(shù)月甚至長(zhǎng)達(dá)一年的時(shí)間才能確定最佳的細(xì)胞克隆。如此漫長(zhǎng)的周期的一個(gè)原因是在 CLD 的早期階段選擇合適的克隆時(shí)遇到了困難。早期細(xì)胞數(shù)量較少，采用靜態(tài)培養(yǎng)。后期則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∨囵B(yǎng)，以擴(kuò)大細(xì)胞產(chǎn)品的產(chǎn)量。從靜態(tài)培養(yǎng)到懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變會(huì)產(chǎn)生不同的細(xì)胞系特征（生長(zhǎng)速率、滴度、代謝特征等）。這阻礙了在早期 CLD 過(guò)程中正確細(xì)胞克隆的識(shí)別。因此，需要大量的克隆進(jìn)行測(cè)試，這增加了 CLD 的成本和所需時(shí)間。為了加快開(kāi)發(fā)進(jìn)程，整個(gè)過(guò)程中保持一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件至關(guān)重要，以便在 CLD 過(guò)程中早期識(shí)別具有正確且可持續(xù)特征的細(xì)胞克隆。
高通量技術(shù)正越來(lái)越多地應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（CLD）流程中。這些技術(shù)能在小規(guī)模的培養(yǎng)皿/試管中提供懸浮培養(yǎng)環(huán)境，并增強(qiáng)氧氣供應(yīng)。在本研究中，我們展示了一種新的系統(tǒng)，即 C.BIRD 微生物反應(yīng)器系統(tǒng)，它能夠在標(biāo)準(zhǔn)的 96 孔板中實(shí)現(xiàn)早期階段的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。C.BIRD 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊，易于放入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中。它有一個(gè)對(duì)接站，可容納三套 C.BIRD 系統(tǒng)（圖 1A）。該系統(tǒng)由兩部分組成：頂部的自主控制箱（圖 1B）和帶有 96 個(gè)圓柱形管的消耗性 C.BIRD 蓋子（圖 1C）。C.BIRD 蓋子上的管子提供了 96/24 個(gè)液流通道，使得在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板中的每個(gè)孔都能吸入和排出空氣。這些通道與氣動(dòng)連接，并由控制系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)，從而在 96 孔板中每個(gè)孔內(nèi)實(shí)現(xiàn) 150 - 200 μL 工作體積的連續(xù)往復(fù)混合（圖 1D）。有了 C.BIRD，就可以在 96 孔板中實(shí)現(xiàn)體積小至 150 - 200 μL 的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的三維懸浮培養(yǎng)環(huán)境。C.BIRD 可以模擬振蕩器的作用。在良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境以及從早期階段就加速細(xì)胞系分化（CLD）進(jìn)程的情況下，從而為細(xì)胞更好地生長(zhǎng)以及克隆特征的可預(yù)測(cè)性提供了新的可能性。
本對(duì)比實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)如圖 2A 所示。我們研究了 mAb CHO-K1 和 CHO-S 細(xì)胞系在兩種不同規(guī)模（從 200 μL 96 孔板到 30 mL 攪拌瓶）下的每日細(xì)胞生長(zhǎng)、倍增時(shí)間以及蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并比較了 96 孔板中的兩種不同培養(yǎng)條件——標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)培養(yǎng)和 C.BIRD 懸浮培養(yǎng)。我們的結(jié)果表明，采用懸浮培養(yǎng)的 C.BIRD 系統(tǒng)表現(xiàn)出優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)的優(yōu)越性能，并且與攪拌瓶培養(yǎng)表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)募?xì)胞系特征。更重要的是，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線與攪拌瓶培養(yǎng)的晚期階段曲線非常相似，這是早期細(xì)胞克隆選擇和可預(yù)測(cè)性的一個(gè)重要特征。
在培養(yǎng)細(xì)胞五天后，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)分別實(shí)現(xiàn)了每毫升 4.4×10^6 個(gè)細(xì)胞和 4.9×10^6 個(gè)細(xì)胞的活細(xì)胞密度，而靜態(tài)培養(yǎng)在第五天僅達(dá)到 1.2×10^6 個(gè)細(xì)胞/毫升（圖 2B）。
細(xì)胞密度的 3.5 倍差異表明，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)為最大化細(xì)胞生長(zhǎng)提供了更理想的生長(zhǎng)條件。
同樣，每個(gè)條件下的總細(xì)胞密度也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。96 孔 C.BIRD 培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)分別實(shí)現(xiàn)了每毫升 5.2×10^6 個(gè)細(xì)胞和 5.7×10^6 個(gè)細(xì)胞的總細(xì)胞密度，而靜態(tài)培養(yǎng)在第五天僅達(dá)到 2.0×10^6 個(gè)細(xì)胞/毫升（圖 2C）。這些數(shù)據(jù)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明在 96 孔規(guī)模下，C.BIRD 培養(yǎng)提供了最理想的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。對(duì)三種培養(yǎng)條件的可行性比較表明C.BIRD 培養(yǎng)法的表現(xiàn)優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)法，其細(xì)胞存活率保持較高水平，與搖瓶培養(yǎng)條件相當(dāng)。C.BIRD 培養(yǎng)法和搖瓶培養(yǎng)法在第 5 天時(shí)細(xì)胞存活率仍保持較高水平，分別為 84.3% 和 86.3%。然而，靜態(tài)培養(yǎng)法在第 5 天時(shí)細(xì)胞存活率降至 60.3%（圖 2D）。
且與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 培養(yǎng)法顯著縮短了細(xì)胞的倍增時(shí)間，從 114 小時(shí)縮短至 38.5 小時(shí)。在搖瓶培養(yǎng)（35.1 小時(shí)）和 C.BIRD 培養(yǎng)（38.5 小時(shí)）之間，細(xì)胞的分裂時(shí)間沒(méi)有顯著差異。結(jié)果表明，96 孔 C.BIRD 具有高性能水平，并且能夠在早期提供搖瓶生長(zhǎng)條件（圖 2E）。
最后，每種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞系蛋白質(zhì)產(chǎn)量呈現(xiàn)出相同的模式。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 培養(yǎng)下的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的倍數(shù)變化顯著更高（高 0.7 倍），而 C.BIRD 和搖瓶之間的倍數(shù)變化沒(méi)有顯著差異（2.86 倍對(duì) 3.21 倍），如圖 2F 所示。
在第 5 天，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)達(dá)到活細(xì)胞密度 5.54×10^6 個(gè)/mL，搖瓶培養(yǎng)達(dá)到 7.07×10^6 個(gè)/mL，而靜態(tài)培養(yǎng)僅達(dá)到 1.68×10^6 個(gè)/mL。（圖 3A）。就總細(xì)胞密度而言，96 孔 C.BIRD 培養(yǎng)達(dá)到 6.48×10^6 個(gè)/mL，搖瓶培養(yǎng)為 1.2×10^6 個(gè)/mL，而靜態(tài)培養(yǎng)為 1.68×10^6 個(gè)/mL。（圖 3B）
C.BIRD 懸浮培養(yǎng)組和靜態(tài)培養(yǎng)組之間細(xì)胞密度約有 3 倍的差異，這進(jìn)一步證實(shí)了 C.BIRD 懸浮培養(yǎng)組提供了比靜態(tài)培養(yǎng)更好的生長(zhǎng)條件。
第 5 天的細(xì)胞活力比較顯示，C.BIRD 培養(yǎng)組優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)組，細(xì)胞活力保持較高水平。C.BIRD 培養(yǎng)組的細(xì)胞活力維持在 86%，與搖瓶培養(yǎng)組的 99% 相當(dāng)。然而，靜態(tài)培養(yǎng)組的細(xì)胞活力在第 72 小時(shí)下降到 72%（圖 3C）。
與靜態(tài)培養(yǎng)組相比，C.BIRD 在第 4 天顯著縮短了細(xì)胞倍增時(shí)間，從 48.6 小時(shí)縮短至 28.1 小時(shí)，而搖瓶培養(yǎng)組的倍增時(shí)間為 26.2 小時(shí)。這些結(jié)果證實(shí)了 96 孔 C.BIRD 的高表現(xiàn)及其在早期階段提供搖瓶培養(yǎng)條件的能力（圖 3D）。
最后，每種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞系蛋白質(zhì)產(chǎn)量都呈現(xiàn)出相同的模式，驗(yàn)證了我們的陳述。在第 5 天，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)組的 CHO-S 細(xì)胞產(chǎn)生了 23.52 μg/mL 的蛋白質(zhì)。在搖瓶培養(yǎng)中，細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體（mAb）濃度為 24.68 μg/mL，而使用小鼠腹腔細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中單克隆抗體的濃度為 100 μg/mL。C.BIRD 的蛋白質(zhì)產(chǎn)量也顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)（15.08 μg/mL），高出 1.5 倍（圖 3E）。
本研究表明，用于細(xì)胞系開(kāi)發(fā)的 C.BIRD 微生物反應(yīng)器在以下三個(gè)方面顯著改善了 96 孔培養(yǎng)環(huán)境中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)：1）細(xì)胞生長(zhǎng)；2）倍增時(shí)間；3）蛋白質(zhì)產(chǎn)量
我們還證明了 C.BIRD 系統(tǒng)在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和蛋白質(zhì)產(chǎn)量方面與搖瓶培養(yǎng)方式高度相似。總之，C.BIRD 系統(tǒng)能夠使細(xì)胞更早地過(guò)渡到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方式，并且在標(biāo)準(zhǔn)的 96 孔板中具有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)速率，這有可能為后續(xù)的連續(xù)流分離（CLD）過(guò)程提供更好的向大規(guī)模搖瓶/生物反應(yīng)器條件的轉(zhuǎn)化。
