在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，單細(xì)胞生物學(xué)已成為研究細(xì)胞異質(zhì)性和癌癥生物學(xué)所涉及的細(xì)胞信號(hào)通路（如免疫耐受）的重要工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)尤其被用于了解腫瘤細(xì)胞的復(fù)雜性以及與疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)（包括耐藥性）相關(guān)的特定生物標(biāo)記物。然而，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的質(zhì)量在很大程度上依賴于細(xì)胞分離和樣本制備，以保持RNA的質(zhì)量，并在生成cDNA和制備文庫(kù)之前去除死細(xì)胞和碎片。流式分選可用于收集特定細(xì)胞群，并清除死亡或?yàn)l死細(xì)胞。然而，使用高壓液滴形成的傳統(tǒng)細(xì)胞分選方法會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞，導(dǎo)致基因表達(dá)變化或RNA整體降解。此外，傳統(tǒng)高壓流式會(huì)產(chǎn)生具有生物危害性的氣溶膠，存在樣本間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
WOLF柔性單細(xì)胞分選儀是一種低壓微流體細(xì)胞分選儀（>2 psi），用于溫和地分選細(xì)胞，不會(huì)像傳統(tǒng)流式高壓噴嘴形成液滴，采用可拋棄式微流控芯片，進(jìn)一步降低了生物危害，因此樣本和鞘液接觸到的一切都是無(wú)菌、一次性的，不會(huì)造成樣本間的污染。為了展示這種溫和的無(wú)菌細(xì)胞分選儀如何影響 10x 基因組學(xué)工作流程中的單細(xì)胞 RNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)，我們與一家大型癌癥中心的學(xué)術(shù)流式細(xì)胞儀核心合作，比較未分選的小鼠前列腺細(xì)胞與NanoCellect WOLF細(xì)胞分選儀和BectonDickenson FACSAriaTM II分選的細(xì)胞的樣本。
下圖顯示了兩種分選儀的分選圖。100,000個(gè)細(xì)胞在BD FACSAria II和NanoCellect WOLF上進(jìn)行分選。然后大約5000個(gè)細(xì)胞進(jìn)入10x Chromium Controller。將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，使用Chromium Single Cell 3' v3 Kit生成文庫(kù)，并使用Illumina進(jìn)行測(cè)序。所有樣本都用10x Genomics Cell Ranger Pipeline進(jìn)行分析以檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量。在不同的日期進(jìn)行了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（每次實(shí)驗(yàn)3-5只小鼠）。BD FACSAria II和NanoCellect WOLF樣品在同一天進(jìn)行平行分選和測(cè)序處理。BD FACSAria II分選兩個(gè)樣本，因?yàn)橐粋€(gè)BD FACSAria II分選樣本產(chǎn)生的結(jié)果不具可比性。
在所有三種條件下，10x Genomics Chromium Controller 的細(xì)胞均回收5,000個(gè)細(xì)胞：1）未分選樣本；2）BD FACSAria II分選樣本；3）NanoCellect WOLF分選樣本。回收細(xì)胞的數(shù)量受幾個(gè)因素的影響：無(wú)活力細(xì)胞的百分比、細(xì)胞聚集以及細(xì)胞濃度的高估/低估?？偨Y(jié)顯示，未分選樣本平均回收了3064個(gè)細(xì)胞，BD FACSAria II分選樣本平均回收了4440個(gè)細(xì)胞，NanoCellect WOLF分選樣本平均回收了4955個(gè)細(xì)胞（下圖A）。未分選樣本的細(xì)胞回收率最低，而WOLF分選樣本的細(xì)胞回收率最接近目標(biāo)數(shù)量。由于未分選樣本中含有可被算作細(xì)胞的碎屑和死細(xì)胞，這可能導(dǎo)致高估了裝載的存活細(xì)胞，從而導(dǎo)致未分選樣本和BD FACSAria II樣本中回收的細(xì)胞數(shù)量較少。
每個(gè)細(xì)胞的基因中位數(shù)和每個(gè)細(xì)胞的唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）中位數(shù)都是衡量文庫(kù)復(fù)雜性的指標(biāo)。WOLF分選樣本的每個(gè)細(xì)胞基因中位數(shù)（1,711個(gè)）和每個(gè)細(xì)胞獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符中位數(shù)（4,932個(gè)，下圖B，C）平均最高。Cell Ranger Summary還顯示了與細(xì)胞無(wú)關(guān)的讀數(shù)比例，這是無(wú)細(xì)胞污染RNA的指標(biāo)。在這一指標(biāo)中，WOLF分選樣本與細(xì)胞無(wú)關(guān)的讀數(shù)百分比最低（10.3%），而未分選樣本的百分比最高，這與較高的碎片和死細(xì)胞存在率（19.2%）一致（下圖D）。這些結(jié)果表明，經(jīng)WOLF分選的樣本中來(lái)自碎片和死細(xì)胞的污染RNA數(shù)量最少。
條形碼等級(jí)圖通過顯示 1）與細(xì)胞相關(guān)的條形碼；2）來(lái)自空分區(qū)的條形碼之間是否存在明顯的分隔，來(lái)幫助評(píng)估RNA的完整性。與活細(xì)胞相關(guān)的條形碼的UMI計(jì)數(shù)應(yīng)大大高于無(wú)細(xì)胞或低質(zhì)量細(xì)胞的背景條形碼。因此，在RNA質(zhì)量較高的樣本中，UMI計(jì)數(shù)和條形碼之間會(huì)出現(xiàn)陡峭的斜坡或下降。下圖顯示了每個(gè)樣本的UMI與條形碼對(duì)比圖，與未分選的對(duì)照樣本相比，在BD FACSAria II和WOLF分選樣本中可以觀察到更陡峭的斜坡或彎頭（高亮圓圈）。這些結(jié)果表明，在10x Genomics工作流程的上游使用細(xì)胞分選儀可提高RNA質(zhì)量，同時(shí)減少來(lái)自無(wú)細(xì)胞來(lái)源的污染RNA。WOLF分選樣本的UMI計(jì)數(shù)也更高，反映出細(xì)胞分選過程對(duì)細(xì)胞的損傷更小。
該實(shí)驗(yàn)表明，使用BD FACSAria II或WOLF進(jìn)行樣本制備，可減少碎片和死細(xì)胞對(duì)RNA的影響，從而獲得更高質(zhì)量的scRNA測(cè)序結(jié)果。此外，這些數(shù)據(jù)還表明，使用細(xì)胞分選儀去除死細(xì)胞和碎片可提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。
雖然WOLF和BD FACSAria II分選的樣本都能產(chǎn)生較高的文庫(kù)復(fù)雜度和較低的與條形碼無(wú)關(guān)的讀數(shù)，但WOLF分選的樣本顯示出最有利的結(jié)果，與傳統(tǒng)的液滴式細(xì)胞分選儀相比，使用簡(jiǎn)單易用的微流控細(xì)胞分選儀進(jìn)行樣本富集的RNA完整性更高。因此，在10x基因組學(xué)工作流程中使用溫和的細(xì)胞分選儀（如WOLF細(xì)胞分選儀）進(jìn)行細(xì)胞分選是產(chǎn)生高質(zhì)量scRNA測(cè)序結(jié)果的更有利的方法。
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